微波輔助提取金釵石斛多糖及體外抗氧化研究

鄧維澤，古霞，閆天龍，李明元，，*，唐顯福，楊文宇（.西華大學生物工程學院四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都60039；.貴州仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

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微波輔助提取金釵石斛多糖及體外抗氧化研究

鄧維澤1，古霞1，閆天龍1，李明元1，2，*，唐顯福2，楊文宇1
（1.西華大學生物工程學院四川省食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.貴州仙草生物科技有限公司，貴州赤水564700）

摘要：采用微波輔助提取金釵石斛多糖，通過單因素正交試驗法考察料液比、提取功率、粉碎程度和輻射時間對金釵石斛多糖提取率的影響，確定其最佳提取條件；通過金釵石斛多糖對ABTS+自由基清除作用測定其體外抗氧化活性。結果表明：微波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶20（g/mL），提取功率為400 W，粉碎程度60目，輻射時間為30 min，在此條件下多糖得率為3.16%。金釵石斛精制多糖對ABTS+自由基的清除率可達81.9%，表明其具有良好體外抗氧化作用。

關鍵詞：金釵石斛多糖；微波輔助提取；工藝優化；正交試驗；體外抗氧化

金釵石斛，又名金釵石，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物［1］，是我國傳統名貴中藥。金釵石斛入藥始載于《神農本草經》，被列為上品，因其生長在特殊的環境和具有強大的滋補功效而享有“民間仙草，植物黃金”的美譽。金釵石斛可“強陰益精，厚腸胃，狀筋骨，暖水臟，補腎益力，輕身延年”，具有抗衰老、增強免疫力等功效［2-5］，其主要的功效成分是石斛堿及多糖類物質。金釵石斛是國家批準可用于保健食品的物品名單之一，其所含的石斛堿和石斛多糖決定了保健功能類別。目前，對于金釵石斛研究大多集中在石斛堿上，對于金釵石斛多糖提取工藝及其活性研究鮮見報道。本試驗通過正交試驗優化微波提取金釵石斛多糖工藝，并探究金釵石斛多糖體外抗氧化活性，為進一步金釵石斛多糖分離純化及其活性的研究提供一定的基礎，為金釵石斛多糖產品的研發提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

金釵石斛：貴州仙草生物科技有限公司提供，在實驗室烘干、粉碎成40、50、60、70、80目等目數的試驗材料備用；透析袋：成都奧克生物技術有限公司；活性炭：上海輝業化工科技有限公司。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器

UV2800紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；MF-2270EG型微波爐：青海海爾制品有限公司；RE-52A型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；Alphal-2LD plus冷凍干燥機：德國CHRIST；DHG-9920A恒溫鼓風干燥箱：品相科儀有限公司；HH-S8恒溫水浴鍋：金壇市華特實驗儀器有限公司；FA/JA2104電子天平：常州宏衡電子儀器廠；OM-4A索式提取器：上海歐蒙實業有限公司；TG18G離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；BF-20粉碎機：石家莊本辰機電設備有限公司。

1.2.2主要試劑

ABTS自由基［2，2-azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulfonate）］：購自美國Sigma公司；VC、過硫酸鉀、石油醚、無水乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿：均為分析純。

1.3方法

1.3.1試驗樣品的前處理

稱取金釵石斛干燥粉末，置于索氏提取器中，加入6倍體積石油醚80℃回流提取1 h，濾渣揮干溶劑，加入10倍體積80%乙醇，70℃回流提取2次，每次1 h，趁熱抽濾，濾渣揮干溶劑，60℃干燥至恒重備用。

1.3.2金釵石斛粗多糖得率計算

金釵石斛粗多糖得率計算見公式（1）。

1.3.3金釵石斛多糖提取單因素試驗

準確稱取前處理干燥的金釵石斛粉10.0 g，放入500 mL的錐形瓶中，以水作為提取溶劑，在其他條件相同的情況下，采用不同的料液比、微波功率、物料粒度、輻射時間進行微波輔助提取試驗，然后趁熱過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇使溶液含乙醇至80%，靜止過夜，離心得沉淀，真空冷凍干燥至恒重，稱量。按照公式（1）計算金釵石斛粗多糖得率，逐個考察各提取條件對提取效果的影響，確定每一因素的最佳水平。

1.3.4金釵石斛多糖提取正交試驗

根據1.3.3單因素試驗結果，選取料液比、微波功率、物料粒度、輻射時間4個因素及3個最佳水平進行正交試驗L9（34），微波輔助提取后趁熱過濾，減壓濃縮，加入無水乙醇使溶液含乙醇至80%，靜止過夜，離心得沉淀，真空冷凍干燥至恒重，稱量。按公式（1）計算金釵石斛粗多糖得率，確定金釵石斛多糖提取的最佳條件。

1.3.5金釵石斛精制多糖的制備

將金釵石斛粗制多糖加蒸餾水溶解，溶液用活性炭除色素，Sevage法除去蛋白質，反復操作直至紫外-可見光掃描無明顯蛋白質吸收峰為止。用透析袋48 h流水透析，蒸餾水透析24 h，除去無機鹽、小分子雜質及未除盡的色素，將透析袋內多糖液醇沉，離心得沉淀，用無水乙醇、丙酮各洗2遍，真空冷凍干燥至恒重即金釵石斛精制多糖［6-7］。

1.3.6金釵石斛多糖對ABTS+自由基清除率試驗

精確稱取一定量的金釵石斛粗多糖、金釵石斛精制多糖和VC，均配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL等5個濃度的待測液。金釵石斛多糖清除ABTS+自由基的試驗分組、試驗加樣量及順序見表1。

表1　金釵石斛多糖清除ABTS+自由基試驗加樣量及順序Table 1 The test sample amount and order of Dendrobium nobile Lindl. Polysaccharides scavenging activity against ABTS+free radical

按照表1操作，分別計算金釵石斛粗多糖、金釵石斛精制多糖、VC對ABTS+自由基的清除率，清除率（P）的計算公式為：

式中：A0為空白組吸光度；Ai為樣品組吸光度。

2　結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1料液比對多糖得率的影響

在微波功率300 W、輻射時間30 min、物料粒度40目的條件下，依1.3.3的試驗方法，研究料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）時對多糖得率的影響，結果如圖1所示。

圖1　料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate extraction rate of polysccharides

由圖1可知，當料液比大于1∶20（g/mL）時，金釵石斛多糖提取得率隨料液比的減小而提高，當料液比小于1∶20（g/mL）時，金釵石斛多糖提取率隨料液比繼續減小，金釵石斛多糖提取率基本不變，從試驗條件和后期處理成本出發，選擇1∶20（g/mL）為最佳料液比。

2.1.2微波提取功率對多糖得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、輻射時間30 min、物料粒度40目的條件下，依1.3.3的試驗方法，研究微波提取功率為100、200、300、400、500 W時對多糖得率的影響，結果如圖2所示。

圖2　微波提取功率對多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on of polysccharides extraction rate of polysccharides

由圖2可知，金釵石斛多糖提取得率隨著微波提取功率增大而提高，這主要是由于輻射時間一定，輻射功率越高，物質吸收微波能越多，對物質細胞的破換作用越大，有利于有效成分浸出，但是當微波功率過高時，瞬間加熱作用會使液體沸騰溢出，反而影響多糖提取得率，不利于試驗的進行。因此選擇400 W為最佳微波提取功率。

2.1.3輻射時間對多糖得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、微波提取功率400 W、物料粒度40目的條件，依1.3.3的試驗方法，研究輻射時間為10、20、30、40、50 min時對多糖得率的影響，結果如圖3所示。

圖3　輻射時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of radiation time on extraction rate of polysccharides

由圖3可知，輻射時間在40 min之前，隨著時間的增加，多糖提取得率逐漸升高，但當時間超過40 min時，金釵石斛多糖提取得率反而出現有所下降的趨勢，這可能是由于溶解度達到飽和，有效成分不在被溶解，多糖產生降解現象［8-9］。因此，最佳輻射時間選擇40 min。

2.1.4物料粒度對多糖得率的影響

在料液比1∶20（g/mL）、微波提取功率400 W、輻射時間40 min的條件，依1.3.3的試驗方法，研究物料粒度為40、50、60、70、80目時對多糖得率的影響，結果如圖4所示。

圖4　物料粒度對多糖得率的影響Fig.4 Effect of material diameter on extraction rate of polysccharides

由圖4可知，隨著物料粒度目數的增大，金釵石斛多糖提取得率逐漸增大，當物料粒度目數達到60目以后，多糖提取得率隨目數的增大基本不變，這可能是有效成分溶出已達飽和。

2.2正交試驗結果

金釵石斛多糖提取效果受多個因素的交叉影響，上述試驗只是單因素影響，為了確定在提取過程中這4個因素對金釵石斛多糖提取效果的影響大小，選出最佳的提取條件。依“1.3.4”的試驗方法，正交試驗設計見表2，正交試驗結果見表3所示。

由表3可知，從極差R的大小可以看出影響金釵石斛多糖提取的4個因素的主次關系是：微波功率＞輻射時間＞物料粒度＞料液比。因素C的極差很小，所以將此列作為方差分析的誤差列［10］，結果見表4。

表2　正交試驗四因素三水平L9（34）表Table 2 Four factors and three levels of L9（34）of orthogonal test

表3　正交試驗結果的直觀分析表Table 3 Visual analysis of orthogonal test result

表4　方差分析表Table 4 Analysis of variance table

F檢驗表明，B因素（微波功率）P＜0.01，D因素（輻射時間）P＜0.05，說明在B因素所設的不同水平下對金釵石斛提取效果有極顯著性差異，在D因素所設不同水平下有顯著性差異，其他因素各水平間差異均不顯著。

從表3中k值所得，正交試驗最優水平組合為A2B2C2D2，即微波輔助提取金釵石斛多糖最佳工藝條件為：物料粒度60目，微波提取功率為400 W，料液比為1∶20（g/mL），輻射時間為30 min。

按以上最佳條件進行了驗證試驗，所得金釵石斛多糖得率為3.16%，比正交試驗中的最高金釵石斛多糖得率3.05%提高了0.11%。

2.3金釵石斛多糖對ABTS+自由基清除作用

ABTS+自由基清除法常用于評估生物樣品總抗氧化能力［11-12］。在反應體系中，ABTS+經氧化后生成相對穩定的藍綠色ABTS+水溶性自由基，抗氧化劑與ABTS+自由基反應后使其溶液褪色，特征吸光值降低，溶液退色越明顯則表明所檢測物質的總抗氧化能力越強。金釵石斛多糖及VC對ABTS+自由基的清除作用見圖5。

圖5　金釵石斛多糖及VC對ABTS+自由基的清除作用Fig.5 Comparison of ABTS+free adical scavenging capacity between Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides and VC

由圖5可知，在質量濃度0.5 mg/mL～2.5 mg/mL范圍內，隨著VC濃度的增加，VC對ABTS+自由基清除率逐漸增加，在2.5 mg/mL時達到93.8%；金釵石斛精制多糖和粗多糖在試驗濃度范圍，隨著質量濃度的增加，他們對ABTS+自由基的清除率逐漸增加，精制多糖對ABTS+自由基的清除率最高可以達到81.9%，接近VC對ABTS+自由基的清除率，粗多糖對ABTS+自由基的清除率最高可達到44.3%。總體上，清除ABTS+自由基的能力大小是VC＞精制多糖＞粗多糖。

3　結論與討論

1）本試驗通過單因素及正交試驗得出了微波輔助提取金釵石斛多糖的最佳提取工藝條件為：物料粒度60目，微波提取功率400 W，料液比為1∶20（g/mL），輻射時間30 min。在此條件下金釵石斛多糖的提取得率達3.16%，各個因素對金釵石斛多糖得率的影響作用大小順序依次為微波提取功率＞輻射時間＞物料粒度＞料液比，這為金釵石斛多糖的深入研究及開發為相關的產品提供一定的理論參考。

2）金釵石斛多糖表現出良好的清除ABTS+自由基的能力，特別是金釵石斛精制多糖對ABTS+自由基的清除率可達81.9%，接近VC對ABTS+自由基的清除率，是一種潛在的新型抗氧化劑。

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Microwave-assisted Extraction and in Vitro Antioxidant Activity Evaluation of Polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl.

DENG Wei-ze1，GU Xia1，YAN Tian-long1，LI Ming-yuan1，2，*，TANG Xian-fu2，YANG Wen-yu1
（1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan，College of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China；2. Xian Cao Biological Technology Co.，Ltd.，Chishui 564700，Guizhou，China）

Abstract：Crude polysaccharides were extracted from Dendrobium nobile Lindl. by microwave-assisted. Optimal extraction conditions were explored to evaluate the effects of solvent to material ratio，extraction power，material diameter and extraction time on extraction rate of polysaccharides through single factor orthogonal test method. Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides in vitro antioxidant activity were measured by its scavenging effect on ABTS+free radical. The results showed that the optimal microwave-assisted extraction conditions of polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl. were the material-liquid ratio of 1∶20（g/mL），the extraction power of 400 W，the extraction material diameter of 60 mesh and the extraction time of 30 min. Under the optimal extraction conditions，the extraction rate of polysaccharides was up to 3.16%. Dendrobium nobile Lindl. refined polysaccharides on the clearance rate of ABTS+free radical could reach 81.9%.Therefore，the polysaccharides from Dendrobium nobile Lindl. have strong antioxidant activity in vitro.

Key words：Dendrobium nobile Lindl. polysaccharides；microwave-assisted extraction；process optimization；orthogonal test；antioxidant in vitro

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.013

基金項目：貴州省遵義市中藥重大專項赤中藥科合（201306）

作者簡介：鄧維澤（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品營養保健。

*通信作者

收稿日期：2015-03-12