氙氣聯合亞低溫對少突膠質前體細胞糖氧剝奪后的保護作用

孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕

氙氣聯合亞低溫對少突膠質前體細胞糖氧剝奪后的保護作用

孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕

目的 研究氙氣聯合亞低溫對少突膠質前體細胞（OPCs）糖氧剝奪損傷后的保護作用，探討氙氣對新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）的保護機制。方法 體外培養大鼠原代OPCs，檢測氙氣聯合亞低溫對OPCs糖氧剝奪后凋亡、增殖和分化的影響。結果 各組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中正常對照組（Ctrl）凋亡率最低為（6.3±1.52）%，而OGD對照組（OGD Ctrl）凋亡率最高為（70.3±4.72）%，氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）凋亡率分別為（27.3±3.05）%、（31.6±4.5）%，顯著低于OGD對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），聯合治療組（Xe+HT）凋亡率為（15.6±2.51）%，低于氙氣低溫組或亞低溫組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）；各組OPCs增殖率比較差異無統計學意義；正常對照組細胞呈健康生長，有明顯的三級以上分支的較長網狀突起形成，計算成熟細胞率為（81.0±4.58）%；OGD對照組細胞細胞突起短少而紊亂，次級以上分支減少，成熟細胞率為（14.6±3.51）%，OGD對照組與正常對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。氙氣組成熟細胞率（43.6±3.51）%比OGD對照組高，低于亞低溫組（53.3±3.21）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。聯合治療組成熟細胞率（64.6±4.16）%顯著高于單用氙氣或亞低溫組（P＜0.05）。結論 氙氣聯合亞低溫治療能保護OPCs耐受缺氧缺血性損傷的影響，可能是其對HIE的神經保護機制之一。

氙氣；亞低溫；糖氧剝奪；少突膠質前體細胞

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是一種能導致新生兒死亡及影響神經預后的嚴重疾病。亞低溫療法（hypothermia，HT）是目前唯一被循證醫學證實能改善足月兒HIE的神經系統預后并降低死亡率的方法，但療效仍不夠理想［1-3］。在缺血缺氧性腦損傷的新生動物中，氙氣（Xenon，Xe）具有顯著的神經保護特性并可與亞低溫起協同效應，可抑制神經元凋亡［4-5］。近年研究證明新生兒缺氧缺血不僅損傷腦灰質而且損傷腦白質［6］，腦白質損傷主要表現為少突膠質前體細胞（oligodendrocyte precursor cell，OPCs）增殖，但能分化成熟形成髓鞘的卻很少［7］。本研究在體外制備OPCs糖氧剝奪損傷模型，模擬體內缺氧缺血過程，探討氙氣聯合亞低溫治療對OPCs增殖和分化的影響，為氙氣對HIE的保護作用機制提供更多的基礎醫學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 新生1日齡SPF級SD大鼠，雄性，由中山醫科大學動物實驗中心提供。Edu細胞增殖檢測試劑盒、熒光二抗及所有細胞培養試劑均購自Gibco，氙氣混合氣體購自深圳特種氣體公司。Tunnel細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche，小鼠抗MBP抗體購自Chemicon。

1.2 少突膠質前體細胞純化分離培養 參考Chen［8］的方法，新生大鼠取大腦進行混合膠質細胞培養，10～12 d后利用振蕩分離和差速貼壁法分離和純化OPCs。

1.3 糖氧剝奪模型（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）及氙氣處理 OPCs增殖培養2 d后更換為經過氮氣處理過的無糖無氧DMEM培養基，對照組為高糖DMEM培養基，OGD組細胞置于三氣培養箱內調節成95%N2，5%CO2，37℃培養120 min，完成糖氧剝奪過程。氙氣組細胞培養基事先通入氙氣混合氣體（50%Xe，25%N2，20%O2，5%CO2）處理，OPCs加入已處理培養基置于密閉的細胞培養罐中，混合氣體充入培養罐10 min后密閉培養24 h。

1.4 實驗分組 OGD細胞分為對照組（OGD Ctrl），氙氣組（Xe），亞低溫組（HT），及聯合治療組（Xe+HT），此外設無OGD的正常培養對照組（Ctrl）。氙氣組及聯合治療組充入氙氣混合氣體，其它治療組氣體為75%N2，20%O2，以及5%CO2。OGD后亞低溫組及聯合治療組培養箱溫度為33℃，其余組為37℃。

1.5 OPCs凋亡、增殖及分化檢測 收集各組處理24 h后細胞，Tunnel免疫熒光染色檢測凋亡，凋亡率以Tunnel陽性細胞數占DAPI染色陽性的總細胞數比例來表示；或更換正常OPCs增殖培養基培養48 h，Edu法檢測細胞增殖，Edu標記陽性率=陽性細胞數/細胞總數×100%；另外一部分細胞則在處理后進行OPCs分化培養，5 d后進行MBP免疫熒光染色。計算有三級以上分支，且突起長度超過胞體3倍以上的細胞所占的比例，即成熟細胞率。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件包分析本研究數據。計量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，之后兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率的比較 方差分析顯示各組細胞凋亡率比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中正常對照組（Ctrl）因細胞在正常條件下培養凋亡率最低為（6.3±1.52）%，而OGD對照組（OGD Ctrl）凋亡率最高為（70.3±4.72）%，氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）凋亡率分別為（27.3±3.05）%、（31.6±4.5）%，顯著低于OGD對照組，比較差異有統計學意義（P＜0.05），氙氣組（Xe）和亞低溫組（HT）比較差異無統計學意義，聯合治療組（Xe+HT）凋亡率為（15.6±2.51）%，低于單用氙氣或亞低溫組，比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組OPCs增殖率的比較 Ctrl組、OGD Ctrl組、Xe組、HT組、Xe+HT組OPCs增殖率分別為（53.6±3.05）%、（47.6± 2.51）%、（56.0±5.57）%、（48.3±7.76）%、（49.0±4.05）%，方差分析顯示各組OPCs增殖率比較差異無統計學意義。

2.3 氙氣或/和亞低溫處理改善OPCs糖氧剝奪損傷對分化的影響 正常對照組細胞呈健康生長，有明顯的三級以上分支的較長網狀突起形成，計算成熟細胞率為（81.0±4.58）%；OGD對照組細胞細胞突起短少而紊亂，次級以上分支減少，成熟細胞率為（14.6±3.51）%，OGD對照組與正常對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）。氙氣組成熟細胞率（43.6±3.51）%比OGD對照組高，低于亞低溫組（53.3±3.21）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。聯合治療組成熟細胞率為（64.6±4.16）%，顯著高于單用氙氣或亞低溫組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細胞分化培養5 d后成熟細胞率（%）

3 討論

亞低溫療法是目前唯一被循證醫學證實的能改善新生兒缺氧缺血性腦病神經系統預后的治療方法，即通過人工誘導方法將體溫下降3℃～5℃，在生后6 h內實施亞低溫療法并持續72 h，維持體溫在32℃～34℃。亞低溫可抑制缺氧缺血所致生化級聯反應中的眾多環節，多途徑和多靶點對腦組織的保護。但是對重癥HIE的療效仍很差。

氙氣是最穩定的惰性氣體，在體內不進行生物轉化，無毒性和致癌性，吸入后仍以原形式經肺呼出。其不僅是理想的吸入麻醉劑，同時具有良好的器官保護作用，對腦的保護作用尤其突出。在新生動物中，低于麻醉濃度的氙氣具有顯著的神經保護特性并可以與治療性亞低溫起協同作用。氙氣能預防缺血、神經興奮性毒素及心肺轉流所導致的急性神經損傷的形態與功能學變化。體內外動物實驗亦發現氙氣聯合亞低溫比單用二者的任何一種，具有更好的神經保護作用，顯著地改善了神經系統的長期預后，其保護機制可能與抗凋亡有關［9-10］。

本研究發現，在體外培養的少突膠質前體細胞糖氧剝奪損傷的模型中，氙氣或/和亞低溫并不影響OPCs的增殖，但是單用氙氣或亞低溫處理都能減少損傷后OPCs的凋亡，并促進OPCs分化過程中突起的發育和成熟，氙氣與亞低溫聯合使用能增強這種保護作用。OPCs的存活率及是否能正常分化是決定髓鞘能否正常發育的重要因素。本研究結果提示，氙氣聯合亞低溫治療可能在新生兒缺血缺氧性腦損傷時不僅保護神經元，也可保護OPCs，抑制其凋亡，促進其分化成熟，從而改善髓鞘化障礙，改善患兒的神經系統預后。進一步的研究將來可在體內的動物實驗中繼續證實。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.1.012

廣州醫科大學留學歸國人員基金項目（2010 C 31）

廣東 510260 廣州醫科大學附屬第二醫院新生兒科（孫軼 袁艷冰 劉放云 劉海燕）