糖尿病腎病患者高密度脂蛋白抗炎能力的分析

鄭健宇

糖尿病腎病患者高密度脂蛋白抗炎能力的分析

鄭健宇

目的 探討糖尿病腎病患者相對(duì)于正常人高密度脂蛋白抗炎能力是否降低。方法 將正常人和糖尿病腎病高密度脂蛋白分別處理THP-1細(xì)胞，通過(guò)ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6的含量，Western blot檢測(cè)NF-KB的活化。結(jié)果 在LPS刺激下，糖尿病腎病HDL相比于正常人HDL抑制THP-1細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6和NF-KB活化的能力顯著下降。結(jié)論 糖尿病腎病相對(duì)于正常人高密度脂蛋白抗炎能力顯著下降,部分解釋糖尿病腎病動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)升高。

高密度脂蛋白；炎癥因子；慢性腎臟病；動(dòng)脈粥樣硬化

腎臟對(duì)維持機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)、從血液中過(guò)濾代謝產(chǎn)物及排出水分發(fā)揮著重要的功能。慢性腎臟疾病家族史、糖尿病、高血壓的患者更是慢性腎臟疾病的高危人群。近來(lái)的研究表明，慢性腎臟疾病增加了心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。大部分慢性腎臟病患者在疾病發(fā)展的不同階段都有罹患各種心腦血管疾病的可能。歐洲血脂異常管理指南明確提出中重度CKD患者具有極高的心血管總體風(fēng)險(xiǎn)，需要針對(duì)所有危險(xiǎn)因素進(jìn)行積極的干預(yù)治療[2]。高密度脂蛋白（HDL）是一種有益的脂蛋白，具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血糖等一系列的機(jī)體保護(hù)作用。HDL能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的相互作用以及單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[3]。研究認(rèn)為，正常HDL能夠抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的表達(dá)以及炎癥因子TNF-α,IL-1β的釋放[4-5]。但是在慢性腎臟病患者中HDL的抗炎功能是否發(fā)生改變還未有相關(guān)研究。糖尿病腎病是一類由糖尿病導(dǎo)致的慢性腎臟疾病命，發(fā)病率較高。故本研究選用糖尿病腎病患者作為慢性腎病的研究對(duì)象，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年8月～2014年8月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的慢性腎臟病患者18例（CKD組）,以目前早期慢性腎臟病診斷，以持續(xù)出現(xiàn)尿微量蛋白，尿蛋白／肌酐比≥30mg/g并≤300mg/g且出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變作為標(biāo)準(zhǔn)；正常對(duì)照12人（對(duì)照組），行75g無(wú)水葡萄糖耐量及糖化血紅蛋白檢查排除糖尿病，身體健康無(wú)腎病等其它病史。排除伴有高血壓、慢性肝病、其他原因?qū)е碌哪I病、吸煙、家族性高膽固醇血癥、早發(fā)冠心病家族史者。慢性腎臟病患者相對(duì)于正常人尿素氮(BUN)、肌酸(Creatine)、總膽固醇(TC)、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白(LDL)含量均明顯升高，腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)和高密度脂蛋白(HDL)含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

1.2 HDL提取 將正常人血漿加入KBr，調(diào)整密度至1.3g/mL，在4度超速離心250000g離心150min，從上部到試管底部依次將血漿分層：橘紅色的VLDL和LDL，淡黃色的HDL（淡黃色）和無(wú)脂血漿。分別用長(zhǎng)針頭吸取出LDL，HDL放入透析袋然后用0.01M PBS避光透析48h。培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β含量使用達(dá)科為酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)。通過(guò)蛋白印跡（western blot）檢測(cè)NF-kappa B中P65的磷酸化和GAPDH的含量，灰度分析采用Image J進(jìn)行分析，以GAPDH灰度值進(jìn)行校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件20.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，2組均數(shù)間比較采用雙尾Student’s t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.001表示差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖中，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。

表1 2組一般臨床資料比較(x±s)

2 結(jié)果

2.1 慢性腎臟病HDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) 分別用正常人和慢性腎臟病患者HDL預(yù)處理THP-1細(xì)胞2.5h,然后LPS預(yù)處理2.5h,使用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者相對(duì)于正常人HDL抑制LPS介導(dǎo)的TNF-α和IL-1β的釋放能力顯著降低。見(jiàn)圖1。

2.2 HDL通過(guò)NF-kappa B調(diào)節(jié)驗(yàn)證因子的表達(dá) 由于NF-kappa B在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α）、黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1）的表達(dá)中發(fā)揮重要作用，因此檢測(cè)了2組HDL處理THP-1后NF-kappa B中P65亞基的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病HDL抑制P65磷酸化的能力降低。見(jiàn)圖2。

圖1 THP-1分別用LPS刺激，檢測(cè)加入CKD-HDL和N-HDL后4組中TNF-α和IL-1β的含量

圖2 采用western blot檢測(cè)不同HDL處理后THP-1中NF-kappa B P65亞基的磷酸化水平

3 討論

在慢性腎臟疾病中常伴有脂質(zhì)代謝異常，表現(xiàn)為載脂蛋白和血脂水平改變。實(shí)驗(yàn)和臨床研究提示，慢性腎臟病發(fā)展和血脂紊亂有一定關(guān)系,慢性腎功能不全患者早期表現(xiàn)為血TG水平升高,LDL濃度正常，而膽固醇濃度通常正常，甚至降低[6]。HDL水平降低。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相比于正常人、慢性腎臟病患者LDL水平升高，HDL水平降低。

血管炎癥反應(yīng)主要是由于促炎因子與抗炎因子之間的不平衡所導(dǎo)致的[7]。HDL具有動(dòng)脈保護(hù)性效應(yīng)，HDL的抗炎功能是以多種方式發(fā)揮的，在內(nèi)皮細(xì)胞中，正常人的HDL能夠抑制細(xì)胞粘附分子包括ICAM-1、VCAM-1以及E-selectin，抑制IL-8和MCP-1以及誘導(dǎo)抗炎性的TGF-β。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和白細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的相互作用在動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用是由定位在這些細(xì)胞表面的粘附分子包括血管細(xì)胞粘附分子（VCAM-1）、細(xì)胞間粘附分子（ICAM-1）和E-選擇素（E-selectin）介導(dǎo)下發(fā)生的。腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）作為炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)，它主要是由單核巨噬細(xì)胞受到各種因素的刺激被激活后合成和分泌的,可以促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，以及激活巨噬細(xì)胞，推動(dòng)斑塊的形成以及不穩(wěn)定性的發(fā)展。TNF-α和IL-1β還可激活內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附分子（VCAM-1、ICAM-1），使其表達(dá)活性增加[8]。這些粘附分子吸引單核白細(xì)胞吸附在內(nèi)皮組織上并且進(jìn)一步往內(nèi)膜方向遷移，使炎癥反應(yīng)進(jìn)而在血管壁上啟動(dòng)[9]。TNF-α和

IL-1β除可作用于巨噬細(xì)胞并將其激活外，還促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生、游走，并且能作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞活化、受損，進(jìn)一步導(dǎo)致血管受損和血栓形成[10-11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相比于正常

HDL，慢性腎臟病HDL抑制LPS導(dǎo)致的TNF-α、IL-1β能力降低，因此結(jié)果可以部分解釋慢性腎臟病動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高。

NF-kappa B是一種能調(diào)節(jié)多種炎性和免疫基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常情況下，NF-kappa B與其抑制蛋白結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體復(fù)合物，存在于胞漿內(nèi)。在促炎癥細(xì)胞因子的作用下，NF-kappa B P65亞基磷酸化并移位至細(xì)胞核，其核定位序列與靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子發(fā)生特異性結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。同時(shí)由于NF-kappa B對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中多種炎性介質(zhì)（TNF-α、IL-1β）的表達(dá)起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，所以動(dòng)脈粥樣硬化中NF-kappa B的含量和活性升高可增強(qiáng)多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和生成增多，引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，通過(guò)對(duì)靶基因的作用，NF-kappa B能促進(jìn)單核細(xì)胞的粘附遷移、泡沫細(xì)胞的形成及積聚、平滑肌細(xì)胞的從中膜到內(nèi)膜的遷移增殖。這些作用促進(jìn)粥樣斑塊的形成和發(fā)展，使內(nèi)膜增厚、管腔狹窄，加重病變程度[12]。文獻(xiàn)表明正常狀態(tài)下HDL與apoA-I可以通過(guò)作用于TLR4受體阻斷NF-kappa B的活化[13]，抑制多種炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)和級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)。我們通過(guò)細(xì)胞免疫印跡發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病HDL處理后THP-1中NF-kappa B P65亞基的磷酸化水平相比于正常HDL明顯增高。因此，對(duì)于慢性腎臟病患者，其HDL抑制NF-kappa B P65亞基磷酸化能力降低，炎性介質(zhì)（TNF-α、IL-1β）的表達(dá)增加，進(jìn)一步使大量炎性細(xì)胞積聚浸潤(rùn)于炎癥部位，導(dǎo)致持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)。這些炎癥反應(yīng)促進(jìn)粥樣斑塊的形成和發(fā)展，使內(nèi)膜增厚、管腔狹窄，加重病變程度。

[1] Afkarian M,Katz R,Bansal N,et al.Diabetes,Kidney Disease,and Cardiovascular Outcomes in the Jackson Heart Study[J].Clin J Am Soc Nephrol,2016,6:23.

[2] 王錦溪,李虹偉,趙樹(shù)梅.他汀在慢性腎功能不全患者中的應(yīng)用[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2013,34(1):66-68.

[3] Riwanto M,Landmesser U.High density lipoproteins and endothelial functions:mechanistic insights and alterations in cardiovascular disease[J]. Journal of lipid research，2013,54(12):3227-3243.

[4] Seetharam D,Mineo C,Gormley AK,et al.High-density lipoprotein promotes endothelial cell migration and reendothelialization via scavengerreceptor-B type I[J].Circ Res，2006,98(1):63-72.

[5] Liu D,Ji L,Zhang D,et al.Nonenzymatic glycation of high-density lipoprotein impairs its anti-inflammatory effects in innate immunity[J]. Diabetes Metab Res Rev,2012,28(2):186-195.

[6] Shroff R,Speer T,Colin S,et al.HDL in children with CKD promotes endothelial dysfunction and an abnormal vascular phenotype[J].Journal of the American Society of Nephrology,2014,25(11):2658-2568.

[7] 李瑞雪,張玲.慢性腎臟疾病脂代謝紊亂發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2008,37(15):1742-1744.

[8] Hopkins PN.Molecularbiology of atherosclerosis[J].Physiol Rev,2013，93(3):1317-1542.

[9] Libby P.Inflammation in atherosclerosis[J].Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology,2000,48(2):265-266.

[10] Buckley ML,Ramji DP.The influence of dysfunctional signaling and lipid homeostasis in mediating the inflammatory responses during atherosclerosis[J].Biochim Biophys Acta,2015,129(7):1498-1510.

[11] Pateras I,Giaginis C,Tsigris C,et al.Theocharis S (2014) NF-kappaB signaling at the crossroads of inflammation and atherogenesis:searching for new therapeutic links[J].Expert Opin Ther Targets,2014,18(9):1089-1101.

[12] Hansson GK,Robertson AK，Soderberg-Naucler C.Inflammation and atherosclerosis,Annu[J].Annual Review of Pathology Mechanisms of Disease,2006,1(1):297-329.

[13] Cheng AM,Handa P,Tateya S,et al.Apolipoprotein A-I Attenuates Palmitate-Mediated NF-κB Activation by Reducing Toll-Like Receptor-4 Recruitment into Lipid Rafts[J].PLoS One，2012，7(3):e33917.

Objective To investigate whether the anti-inflammatory effects of HDL is impaired in chronic kidney disease. Methods THP-1 cells were treated with N-HDL (normal),CKD-HDL (chronic kidney disease).TNF-α,IL-1β content was detected with ELISA kit and NF-kappa B phosphorylation were analyzed by western blot.Results CKD-HDL was less effective than N-HDL in TNF-αand IL-6 release inhibition (P＜0.05). NF-kappa B phosphorylation were reduced in CKD-HDL in comparison with N-HDL.Conclusion We found that HDL from chronic kidney disease has a lower anti-inflammatory effects which partially explains why CKD patients have a higher risk of cardiovascular disease.

High density lipoprotein; Inflammatory factors; Chronic kidney disease; Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.21.001

河南 475000 河南省開(kāi)封市中心醫(yī)院輸血科 （鄭健宇）