川芎嗪對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制干預(yù)作用的研究

李　健，張　儉

川芎嗪對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制干預(yù)作用的研究

李健，張儉

廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(廣州 510000)，E-mail：jacky791121@163．com

摘要：目的研究川芎嗪對(duì)膿毒癥大鼠心肌抑制的干預(yù)作用。方法27只 SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)、川芎嗪組(TMP組)，每組9只，在造模后72 h用心臟超聲檢測(cè)大鼠的心功能，檢測(cè)心肌損傷標(biāo)記物以及炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)。結(jié)果與Sham組比較，在造模72 h，CLP組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，而大鼠給予TMP后可提高LVEF值水平，與CLP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。同時(shí)，TMP組大鼠心肌損傷標(biāo)記物心肌肌鈣蛋白T(TnT)以及炎癥介質(zhì)HMGB1較CLP組也明顯減輕(P<0．05)。結(jié)論 川芎嗪有抑制炎癥反應(yīng)，改善膿毒癥大鼠心肌抑制的作用。

關(guān)鍵詞：膿毒癥；心肌抑制；川芎嗪；心肌標(biāo)志物；高遷移率族蛋白B1；大鼠

膿毒癥(sepsis)心肌抑制(sepsis myocardial dysfunction，SMD)是指膿毒癥發(fā)生雙心室的擴(kuò)大和射血分?jǐn)?shù)的降低。其臨床發(fā)生率可達(dá)60%，心輸出量可升高或正常[1]。SMD是膿毒癥死亡的重要原因，心臟作為受累器官之一，其功能受損與膿毒癥病死率升高密切相關(guān)。因此研究膿毒癥心功能障礙的病理機(jī)制意義重大，改善膿毒癥心肌功能障礙，能夠一定程度降低膿毒癥病死率。膿毒癥心肌抑制的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。現(xiàn)在研究認(rèn)為心肌抑制物質(zhì)在膿毒癥心肌抑制中具有重要作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box- 1，HMGB1)是一種重要的炎性介質(zhì)，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜鈣離子內(nèi)流，影響心肌細(xì)胞收縮力[2]。

由此，推測(cè)隨著膿毒癥炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的擴(kuò)大，HMGB1的大量產(chǎn)生加重了膿毒癥心功能障礙。而干預(yù)HMGB1成為治療膿毒癥心肌抑制的潛在靶點(diǎn)。

川芎嗪具有抗凝、抗血小板聚集、抑制炎癥反應(yīng)的作用，被廣泛應(yīng)用于心臟疾病的治療。本研究采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)(CLP) 制備大鼠膿毒癥模型，觀察川芎嗪注射液對(duì)膿毒癥大鼠心功能障礙的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制，為尋找中醫(yī)藥防治膿毒癥并發(fā)心功能障礙的有效途徑提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1．1動(dòng)物模型制備SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量( 220±20) g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。仿照Rittirsch等描述的方法，復(fù)制CLP膿毒癥模型[3]。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周，術(shù)前禁食12 h，以水合氯醛(3．5 mL/kg)麻醉后，于腹前正中作長(zhǎng)約2 cm切口，游離腸系膜和盲腸，以30號(hào)絲線環(huán)形結(jié)扎盲腸根部，結(jié)扎完畢應(yīng)仔細(xì)檢查，保持腸道通路正常。在與腸系膜相對(duì)的盲腸腸壁漿膜面用18號(hào)針頭穿刺2處。針孔之間相距約1 cm。輕輕擠壓腸管使糞便自穿刺點(diǎn)溢出，還納腸管，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)畢腹壁皮下注射生理鹽水5 mL/100 g，進(jìn)行液體復(fù)蘇。術(shù)后自由進(jìn)食食水。

1．2動(dòng)物分組及給藥27只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(CLP組)、川芎嗪組(TMP組)，每組 9只。Sham組除不結(jié)扎和穿刺盲腸，余同CLP組；CLP組采用盲腸結(jié)扎并穿刺法造模，術(shù)后給予皮下注射生理鹽水(10 mL/kg) 進(jìn)行復(fù)蘇，1 次/日；TMP組造模后立即皮下注射川芎嗪注射液(10 mg/kg) ，1次/ 日，99% 高純度川芎嗪粉末(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司) 用生理鹽水溶解至 10 mg/mL 備用。

1．3心臟超聲檢測(cè)心功能使用超高分辨率小動(dòng)物彩色多普勒(Vevo2100，探頭頻率為 12 MHz)。在CLP造模后72 h 分別檢測(cè)大鼠的心功能。腹腔注射 10% 水合氯醛( 3．5 mL/kg) 麻醉，仰臥位固定，胸部備皮，探頭置于左胸，取胸骨旁左室長(zhǎng)軸、心尖兩腔及心尖四腔切面，由二維圖像引導(dǎo)取 M 型曲線進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)量大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(FS、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDSd)、室間隔(IVS)活動(dòng)度、心輸出量(CO)以及心率(P)等。每組數(shù)據(jù)均采連續(xù)3 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1．4血清標(biāo)本采集和保存假手術(shù)組、模型組、川芎嗪組大鼠于制模72 h后采集標(biāo)本。標(biāo)本留取方法：麻醉、常規(guī)消毒動(dòng)物腹部皮膚，無(wú)菌打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈。從腹主動(dòng)脈采取所有血，放置普通玻璃試管，離心(3 000 r/min，15 min)分離血清，置EP管，各標(biāo)本留取兩份，-20℃貯存。無(wú)菌取出所有實(shí)驗(yàn)大鼠心臟，4℃冷生理鹽水沖洗，用液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存。

2結(jié)果

2．1大鼠模型評(píng)定大鼠造模前精神未見異常，喜動(dòng)，自由進(jìn)食及飲水，鼠毛光滑、有光澤，大便成形條狀如常。CLP組12 h大鼠體溫升高，出現(xiàn)活動(dòng)減少等表現(xiàn)。CLP組24 h表現(xiàn)為倦縮俯臥，飲水減少，鼠毛明顯枯燥，大便清稀不成形，CLP組48 h表現(xiàn)為萎靡。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)來(lái)看，符合SIRS到Sepsis的發(fā)展過(guò)程。而TMP組在造模12 h～72 h，大鼠精神較前稍差，活動(dòng)較前稍有減少，能自由進(jìn)食和飲水，鼠毛明顯枯燥，灰白無(wú)光澤，大便尚能成形，72 h時(shí)接近Sham組。Sham組無(wú)變化。按照CLP大鼠模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，在造模后12 h～24 h，選擇臟器功能較差的數(shù)據(jù)作為評(píng)定。結(jié)果顯示，造模后12 h大鼠的體溫下降，呼吸、心率升高，與Sham組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，提示CLP大鼠出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，符合膿毒癥動(dòng)物模型。

2．2大鼠心功能變化造模72 h后，與Sham組比較，CLP組 LVIDd、LVIDs增大，LVEF以及FS降低，其中LVIDs差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0．05)。詳見表1。

在TMP組，腹腔注射TMP后，72 h與CLP同時(shí)點(diǎn)比較皆表現(xiàn)出LVIDd、LVIDs增大，LVEF及FS活動(dòng)度升高。其中LVEF比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，提示TMP可有效改善CLP大鼠心臟心肌活動(dòng)從而改善心功能。

3組代表性心臟彩超圖像詳見圖1。

假手術(shù)組　　　　　　　　　　　模型組　　　　　　　　　　　　川芎嗪組

組別nLVIDd(mm)LVIDs(mm)LVPWd(mm)LVPWs(mm)LVEF(%)FS(%)Sham組 97.125±0.3324.340±0.4391.766±0.1602.694±0.33468.9±4.2537.5±3.28CLP組 98.270±0.6105.448±0.4801)1.824±0.2092.453±0.19257.9±5.6631.3±3.19TMP+CLP組96.443±0.5343.651±0.4061.959±0.1542.644±0.211 65.9±4.422)36.6±3.28 注:LVIDd為左室后壁厚度;LVIWs為左室壁相對(duì)厚度。與Sham組比較,1)P<0.05;與CLP組比較,2)P<0.05。

2．3心肌損傷標(biāo)志物以及HMGB1水平造模后72 h，CLP組及TMP組TnT及HMGB1較Sham組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，提示CLP大鼠存在心肌損傷以及炎癥反應(yīng)損傷。TMP組大鼠72 h TnT及HMGB1水平低于CLP組，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。提示TMP對(duì)CLP大鼠心肌抑制有一定改善作用。詳見表2。

表2　膿毒癥大鼠CLP造模后心肌損傷標(biāo)記物

3討論

在膿毒癥早期就有心肌的器質(zhì)性損傷，而且膿毒癥時(shí)心肌損傷發(fā)生越早，進(jìn)行性惡化的程度越重，病死率就越高，早發(fā)的心肌損傷常常是難治性休克的先兆，死亡率會(huì)明顯增加[4]。加強(qiáng)膿毒癥心功能障礙的防治具有重要的臨床意義。Parker等[5]觀察到膿毒癥心功能障礙病人具有早期出現(xiàn)射血分?jǐn)?shù)降低及左室舒張末容積增加的特點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)心臟超聲檢測(cè)大鼠心功能，與Sham組比較，CLP造模后心功能主要表現(xiàn)為心肌收縮力下降以及左心室擴(kuò)大，這和Parke等[5]的觀察一致，符合膿毒癥高排低阻的血流動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在光學(xué)顯微鏡下觀察到膿毒癥大鼠心肌發(fā)生重度炎癥反應(yīng)，心肌細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，電鏡下觀察到心肌細(xì)胞核發(fā)生固縮、線粒體減少，心肌間質(zhì)重度纖維化。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了膿毒癥時(shí)肌鈣蛋白水平明顯升高，說(shuō)明此時(shí)心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)明顯的損傷。在膿毒癥過(guò)程中，心肌細(xì)胞損傷伴隨著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1表達(dá)的增加，這種變化可能是心功能障礙發(fā)生的原因。

國(guó)外研究證實(shí)，高遷移率族蛋白B1在離體心肌細(xì)胞通過(guò)RAGE和TLR4介導(dǎo)產(chǎn)生顯著的負(fù)性肌力作用和抑制鈣電流，對(duì)離體心肌細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的抑制70%鈣內(nèi)流作用，這種作用在洗脫高遷移率族蛋白B1后部分可逆。因此，認(rèn)為高遷移率族蛋白B1可能是新型的心肌抑制因子，在膿毒癥心功能障礙發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

川芎嗪是中藥川芎的有效提取物，屬酰胺類生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)。現(xiàn)代研究證明，川芎嗪具有抗凝、抗血小板聚集的作用，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。近年的研究還發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有抗炎的作用[6]，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步觀察到其具有保護(hù)肝、腎功能的作用。川芎嗪可明顯提高膿毒癥大鼠下降的LVEF值，減輕心肌損傷標(biāo)記物以及炎癥反應(yīng)介質(zhì)的表達(dá)，川芎嗪有抑制炎癥反應(yīng)、改善膿毒癥大鼠心肌抑制的作用。其機(jī)制可能與拮抗TLR4等炎癥因子介導(dǎo)的對(duì)心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)以及維持細(xì)胞內(nèi)游離鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)，但具體的作用機(jī)制則需進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯王雅潔)

The Protective Effect of Ligustrazine on Sepsis Myocardial Dysfunction in Septic Rats

Li Jian，Zhang Jian

Higher Education Campus Hospital，Guangdong Provintial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510000，Guangdong，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effect of ligustrazine on sepsis myocardial dysfunction in septic rats and its possible mechanism．Methods Twenty-seven rats were randomly divided into sham operated group(Sham group，n=9)，model group(CLP group，n=9)，and ligustrazine treated group(TMP group，n=9)．a(chǎn)fter 72 hours of operation，the levels of serum cardiac troponin I(cTnI)，high mobility group box-1(HMGB1)，and cardiac functions were measured at the same time points．ResultsCompared with sham group，the levels of left ventricular ejection fraction(LVEF) in CLP group decreased(P<0．05)．Compared with CLP group，the levels of LVEF in TMP group elevated(P<0．05)．The levels of cTnT and HMGB1 reduced compared with CLP group(P<0．05)．ConclusionLigustrazine can inhibit inflammatory response and improve sepsis myocardial dysfunction in sepsis rats．

Key words：sepsis；sepsis myocardial dysfunction；ligustrazine；cardiac troponinⅠ；high mobility group box-1；rat

基金項(xiàng)目：廣東省自然基金(No．S2012010010397)

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．011

文章編號(hào)：1672-1349(2016)03-0263-03

(收稿日期：2015-10-07)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·