晚期糖基化終產物對內皮祖細胞功能及成骨分化的影響

汪沁沁，岳溫恒，伍　鋒，賀治青，梁　春，吳宗貴

晚期糖基化終產物對內皮祖細胞功能及成骨分化的影響

汪沁沁，岳溫恒，伍鋒，賀治青，梁春，吳宗貴

摘要：目的觀察糖尿病機體主要的晚期糖基化終產物亞型-Nε羧甲基賴氨酸修飾白蛋白(CMLs)對內皮祖細胞(EPCs)功能及成骨分化作用的影響。方法 采用密度梯度離心法從外周單個核細胞中分離、培養得到EPCs，通過觀察細胞形態和流式細胞儀檢測細胞表面標記鑒定。進一步采用CCK-8增殖試劑盒、Annexin V-FITC/PI流式凋亡試劑盒、transwell小室遷移實驗分別觀察空白對照組、BSA對照組(100 μg/mL)、不同濃度CML-BSA組(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL)，共7組干預液對EPCs增殖、凋亡、遷移功能的影響。并檢測成骨相關鈣化基因BMP-2、ALP、RUNX-2和OCN的表達量，觀察其對EPCs成骨分化能力的影響。結果與BSA對照組相比，CML-BSA能顯著抑制EPCs增殖和遷移的能力，增加凋亡，促進其成骨分化(P<0．05)，其中80 μg/mL濃度變化最明顯(P<0．05)；與BSA對照組相比，CML-BSA能顯著增加成骨相關鈣化基因BMP-2、ALP、RUNX-2和OCN的表達量，呈現濃度依賴性遞增，80 μg/mL濃度變化最大(P<0．05)，100 μg/mL濃度呈現下降趨勢(P<0．05)。結論CMLs能抑制EPCs的增殖和遷移能力，增加其凋亡，顯著促進EPCs成骨分化。深入研究有助于探索糖尿病血管鈣化機制，為臨床干預提供新靶點。

關鍵詞：糖尿病；內皮祖細胞；晚期糖基化終產物；成骨分化

近20年我國糖尿病患病率迅速上升，糖尿病大血管并發癥已成為糖尿病病人致殘和死亡的最主要原因[1]。血管鈣化普遍存在于糖尿病病人，是大血管病理生理基礎。目前認為血管鈣化形成是一個由多種細胞啟動并與骨發育相似的、主動的、高度可調控的生物學過程。血管鈣化主要有兩種形式，一是內膜鈣化，為動脈粥樣硬化的表現之一，由脂質代謝異常和炎癥反應參與，并且與內皮細胞受損，內皮祖細胞(EPCs)修復障礙密切相關，多呈分散的斑片狀沉積，使斑塊不穩定，易導致組織缺血；另一形式是中膜鈣化，主要發生于無炎性細胞浸潤及脂質沉積的環境中，鈣化沉積呈連續線性，彌散于整個富含彈性膠原的終末，與血管平滑肌細胞去分化密切相關[2]。糖尿病發生血管鈣化的原因和機制目前尚不清楚，但鈣化因子的失調起了關鍵性作用。

研究顯示機體長期處于高血糖狀態，可導致蛋白發生轉錄后修飾，形成Schiff堿和Amadori產物，最終形成具有高度活性的糖(AGEs)，其可與RAGEs結合，觸發炎癥、氧化應激反應即“AGEs- RAGEs-氧化應激軸”，導致血管內皮損傷，這被認為是糖尿病血管病變啟動和進展加重最主要的“共同”分子機制[3]。AGEs是一種含有多種亞型的復合物，其中包括CMLs、CELs等，均可與其特異性受體RAGE結合，激活炎癥和氧化應激，參與糖尿病血管損傷病理過程[3]。CML-BSA作為AGEs最主要的亞型，相關的研究較多，且已經商品化，故本研究選用CML-BSA作為高糖致病因素的干預劑。更為重要的是，大量研究證實，AGEs-RAGE軸參與了糖尿病血管鈣化的發生發展，但其具體分子機制不清。 同時，前期研究證明，AGEs-RAGE軸可引起EPCs功能紊亂，導致糖尿病血管損傷后內源性修復障礙。這是否預示著，機體處于高糖環境中，EPCs不但不能起到內源性血管修復的作用，反而參與了血管鈣化的形成，導致大血管粥樣斑塊病變的不穩定，引起急性心血管事件？深入的研究不但有助于揭示糖尿病血管鈣化的新機制，也為今后EPCs的臨床應用提供技術支持和理論依據。

1材料與方法

1．1材料CML-BSA購于美國Cell-Biolabs公司(貨號 STA-314)，使用時，采用PBS稀釋到所需濃度。 DMEM/ F12培養基為美國HyClone公司產品；胎牛血清(Fetal Calf Serum，FBS)為美國GIBCO公司產品。CO2細胞培養箱：美國賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)，型號HERACELL 150i；流式細胞儀：美國BD公司，型號FACSCaliber；酶標儀：美國BioTek公司，型號ELx800NB；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司，型號IX71-A12FL/PH。

1．2EPCs分離、培養及鑒定密度梯度離心法分離健康成人單個核細胞，給予含重組人血管內皮細胞生長因子、重組人堿性成纖維細胞生長因子和10%胎牛血清的M199 培養基培養，3 d后洗去不貼壁的細胞，貼壁細胞繼續給予培養基加生長因子，3 d換液一次，第8天胰酶消化收集貼壁細胞，采用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀鑒定。

1．3分組EPCs分成對照組、BSA組、(20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL)CML-BSA組，共7組，干預24 h。

1．4檢測指標及方法

1．4．1EPCs增殖能力檢測96孔板每孔加入100 μL 2 000個細胞無血清培養基培養12 h同步化后，給予不同干預，每孔加入10 μLCCK-8溶液繼續孵育2 h，酶標儀450 nm測定吸光度，根據實驗孔與對照孔的吸光度計算分析EPCs的增殖情況。每組做5次復孔。

1．4．2EPCs遷移能力檢測96孔板每孔加入100 μL 2 000個細胞無血清培養基培養12 h同步化后，給予不同干預，每孔加入10 μLCCK-8溶液繼續孵育2 h，酶標儀450 nm測定吸光度，根據實驗孔與對照孔的吸光度計算分析EPCs的增殖情況。

1．4．3EPCs凋亡能力檢測將處理后的細胞加入195 μL Annexin V-FITC結合液(1X)重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，1 000 g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液(1X)輕輕重懸細胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。每組重復5次。

1．4．4EPCs成骨分化相關骨化基因檢測采用SYBR Green I嵌合熒光法在illumna公司的EcoTMReal．Time PCR儀上進行Real．Time PCR實驗，所使用的試劑盒為SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus，TaKaRa code：DRR820)，反應條件為預變性95度30秒、PCR反應40個循環95度5秒60度30秒、溶解曲線采集和分析。相關成骨基因的序列詳見表1。

表1　成骨相關基因引物序列

2結果

2．1EPCs培養及鑒定結果(見圖 1)EPCs在培養第3天可見成集落樣生長(圖1A)，第8天可見細胞呈長梭形生長，細胞密集(圖1B)。本課題組之前采用ac-LDL(acetylated- low density lipoprotein)和UEA-1標記EPCs；并通過流式分析細胞表型，結果顯示分離的EPCs表達內皮細胞表面標記物CD34、CD31、CD105、CD73、KDR、CD146和HLA-ADC，且不表達血液中其他單個核細胞的表面標記物CD14、CD45、CD133、CD90和HLA-DR。

注：A為EPCs呈集落生長(箭頭所指為細胞呈集落樣生長)；

B為EPCs呈密集生長(細胞呈長梭狀極性生長)

圖1EPCs的分離與培養(×200)

2．2各組EPCs增殖、遷移、凋亡的比較(見表2)與BSA組比較，CML-BSA組能顯著抑制EPCs的增殖、遷移，促進其凋亡，差異具有統計學意義(P<0．05)。其中80 μg/mL作用最顯著。

表2　各組EPCs增殖、遷移、凋亡功能比較(±s)

2．3各組對EPCs成骨相關基因表達情況(見表3)與BSA組比較，CML-BSA組能顯著增加EPCs成骨分化相關基因BMP-2、ALP、Runx-2、OCN的表達，差異具有統計學意義(P<0．05)。其中80 μg/mL作用最顯著。

表3　各組對EPCs成骨基因mRNA相對表達量(±s)

3討論

血管鈣化普遍存在于糖尿病大血管病變中，易導致急性血管事件，是糖尿病病人致殘和死亡的首要原因，但其機制目前尚不清楚。已知，機體持續高血糖產生的晚期糖基化終產物在血管壁的積聚以及其與晚期糖基化終產物受體相互作用所觸發的氧化應激反應即“AGEs-RAGE-氧化應激軸”，是糖尿病血管病變啟動和進展加重的最主要的“共同”分子機制。

本課題組前期研究發現：AGEs 可通過“AGEs-RAGE-MAPK-NF-κB”途徑誘導人內皮祖細胞功能的紊亂，部分揭示了糖尿病血管病變新的致病機制[4-6]。有研究表示，動脈粥樣硬化內膜鈣化的病人血清中存在OCN(+)EPC，這種EPCs不但不能參與血管損傷后的修復，而且參與了微小鈣化灶的形成[7]。但是AGEs-RAGE軸是否誘發EPCs成骨分化，參與糖尿病血管鈣化及其調控的關鍵因子和相關分子機制仍不清楚。目前，糖尿病動脈粥樣硬化內膜鈣化具體機制不清，相關的研究多集中在BMPs家族的調控作用和鈣磷代謝失衡。日本學者Yusuke Nakagawa教授提出內膜鈣化主要是因為VSMCs接受炎癥、氧化應激等外源性刺激后，可激活BMPs信號通路，導致血管內膜成骨前體細胞發生成骨表型轉化，成骨相關基因Runx2表達增高，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表達增高，進而導致鈣磷代謝異常，形成羥磷灰石結晶，最終形成動脈粥樣硬化內膜微小鈣化灶[8]。這一研究結果和相關理論得到廣泛認可，然而血管壁存在哪些成骨前體細胞需要進一步探索。

糖尿病病人內皮損傷后，內源性血管修復功能障礙，其相關的研究多集中于AGEs引起EPCs功能的紊亂[9]。糖尿病病人的血管，不但修復功能障礙，而且血管粥樣硬化更重、鈣化更重，發生急性血管事件的幾率也更高。近年來的meta-analysis結果就表明，糖尿病病人血管鈣化程度較對照組嚴重，且更易出現急性血管性事件，病人預后差[10]。糖尿病病人機體持續高血糖，易導致微血管和大血管并發癥，其相關的研究多集中于炎癥[11]、氧化應激[12]和免疫失調[13- 14]，然而糖尿病血管并發癥病理變化的焦點是血管鈣化和動脈粥樣硬化，鈣化相關的成骨變化從何而來？目前臨床和基礎研究結果分析，在系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)[15]、風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)[16]等炎癥、免疫為主要病理基礎的疾病合并動脈粥樣硬化內膜鈣化的病人體內，EPCs不但參與內源性血管修復功能異常，更重要的是成骨表型分化，參與鈣化形成和發展。也有研究提出，在C57BL/6 LDLr(-/-)小鼠體內分析動脈粥樣硬化內膜鈣化中細胞來源，發現骨髓來源CD34+CD13+前體細胞(Myeloid CD34+CD13+precursor cells)滲入斑塊，成軟骨樣分化后參與動脈粥樣硬化內膜鈣化，而骨髓來源CD34+CD13+前體細胞就是類似于EPCs的細胞群[17]。大量研究顯示，EPCs可能就是我們一直尋找的最重要的成骨前體細胞，機體持續高糖環境下，不但導致EPCs無法行使血管損傷后內源性修復功能，而且導致EPCs接受成骨調節信號，發生成骨表型的轉化，參與糖尿病動脈粥樣硬化內膜微小鈣化灶的發生和發展。在臨床上，糖尿病和冠心病，一直被認為是“等危癥”，這兩個疾病病理病機相互交聯，相互促進，以至于出現患病發病年輕化、病變嚴重、藥物療效差、病死率高的臨床困境；在基礎研究領域，糖尿病和冠心病存在相同的分子機制，尤其是血管損傷機制。在AGEs的形成過程中，可產生反應性氧的中間產物，這些中間產物可以使蛋白質、脂類等發生氧化，其中尤以脂質過氧化最為重要。這種過氧化物又能促進AGEs的形成。在脂質過氧化物中，低密度脂蛋白的糖基化和氧化又是粥樣硬化的發生發展始動因素和推動因素。因此，AGEs介導的血管損傷研究，無論是糖尿病防治領域，還是冠心病防治領域，都顯得尤為重要。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Advanced Glycation End Products on Function and Osteogenic Differentiation of Human Endothelial Progenitor Cells

Wang Qinqin，Yue Wenheng，Wu Feng，He Zhiqing，Liang Chun，Wu Zonggui

Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Nε-(carboxymethyl) Lysine albumin(CMLs)，a primary advanced glycation end products isoform in diabetic body，on function and osteogenic differentiation of human endothelial progenitor cells(EPCs)．Methods EPCs were isolated and cultured by Ficoll density gradient centrifugation from human mononuclear cells，then were identified to observe cultured cells' morphology and detected cell surface marker by flow cytometry．The cells were exposed to 7 different interventions respectively for 24 hours，including PBS，100 μg/mL BSA，and CML-BSA (20，40，60，80，100 μg/mL)．The proliferation capability of such cells was evaluated using CCK-8 assay，migration ability was explored by transwell assay，and apoptotic rates were investigated by Annexin V-FITC/PI FCM kits．ResultsCompared with the BSA group，proliferation and migration capability of EPCs were inhibited by stimuli with CML-BSA (n=6，P<0．05)，but apoptosis of such cells were promoted，and the concentration of CML-BSA (80 μg/mL) was the most effective one．Compared with the BSA group， the expression levels of osteogenesis-related genes，like bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)，alkaline phosphatase (ALP)，runt-related transcriptional factor 2 (RUNX-2) and osteocalcin (OCN)，were increasing gradually by CML-BSA treatment，and it shown the concentration-dependent．The concentration of CML-BSA (80 μg/mL) was the most effective one，but the effect of concentration of CML-BSA (100 μg/mL) went down．ConclusionCMLs could significantly reduce proliferation，migration，capability，but promote apoptosis and the expression levels of osteogenesis-related genes of EPCs．It could be helpful to explore the mechanism of diabetic vascular calcification，and provide new drug targets for clinical intervention．

Key words：Qiabetes；endothelial progenitor cells；advanced glycation end products；osteogenic differentiation

中圖分類號：R587R255

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．012

文章編號：1672-1349(2016)03-0266-05

Corresponding Author：Wu Zonggui

(收稿日期：2015-12-17)