外周血自然調節性T細胞和主動脈TNF-α在動脈粥樣硬化發展中的表達

羅非同，郝春艷，段虎斌，滕萍萍，陳　青，易　琴

外周血自然調節性T細胞和主動脈TNF-α在動脈粥樣硬化發展中的表達

羅非同，郝春艷，段虎斌，滕萍萍，陳青，易琴

山西醫科大學第一臨床醫學院(太原 030001)，E-mail：352425011@qq．com

摘要：目的探討外周血自然調節性T細胞(natural regulatory T cell，nTreg)和主動脈腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α表達在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發展中的免疫調節作用。方法雄性SD大鼠36只，體重100 g±10 g，隨機分3組，每組12只。健康對照組(A組)、早期動脈粥樣硬化組(B1組)、晚期動脈粥樣硬化組(B2組)。采用高脂高糖飲食配合腹腔注射維生素D3針劑建立大鼠AS模型。流式細胞儀檢測各組大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例，免疫組化檢測大鼠主動脈根部TNF-α表達。結果A組大鼠主動脈根部未見斑塊形成，B1組大鼠主動脈根部可見纖維斑塊形成，B2組大鼠主動脈根部可見粥樣斑塊形成。B1、B2組大鼠血管TNF-α表達較A組上調(P<0．05)。B1組大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例較A組、B2組降低(P<0．05)。結論外周血nTreg在AS不同時期的變化，可能與TNF-α調節有關。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；腫瘤壞死因子α；自然調節性T細胞；大鼠

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的產生是動脈內膜的一個慢性炎癥過程。最近，人們認為此炎癥過程被斑塊抗原介導的免疫反應調節。自然調節性T細胞(natural regulatory T cell，nTreg)在胸腺中產生，其代表為CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞，是一種重要的免疫抑制細胞，對維持機體免疫穩態和抑制自身免疫反應有重要作用。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種多效性細胞因子，具有促炎和免疫抑制雙重效應。TNF的生物學功能是通過兩種在結構上相關，但功能不同的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor Receptor，TNFR)1和TNFR2介導。其中，TNFR2主要介導淋巴細胞的激活和增殖信號[1]。人和老鼠的調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)顯著表達TNFR2，跨膜型TNF較分泌型TNF可更有效的激活TNFR2[2]，使TNF增強Treg活性成為可能。本研究探索AS大鼠外周血nTreg比例與主動脈TNF-α表達在疾病不同階段的變化，探討nTreg和TNF-α在AS發病過程中的免疫調節作用。

1材料與方法

1．1材料流式細胞儀(FACSCalibur型，美國Becton Dickinson公司)，圖像分析系統(BI 2000醫學圖像分析系統，中國成都泰盟軟件有限公司)，抗鼠CD4 FITC、抗鼠CD25 PE、抗鼠Foxp3 APC(美國eBioscience公司)，淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人，大鼠，小鼠TNF-α多克隆一抗(博士德，武漢)，即用型SABC-POD(兔IgG)試劑盒(博士德，武漢)。維生素D3注射液(上海通用藥業股份有限公司)，丙基硫氧嘧啶片(上海朝暉藥業有限公司)。

1．2實驗動物及分組4周齡健康雄性SD大鼠36只，體重100 g±10 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。隨機分兩組：健康對照組(A組12只)、動脈粥樣硬化組(B組24只，分成2個亞組，分別為B1組、B2組)。

1．3實驗步驟

1．3．1造模及標本采集A組喂普通飼料5個月。B1、B2組喂高脂高糖飼料(3%膽固醇、0．5%豬膽鹽、10%豬油、5%白糖、0．2%丙基硫氧嘧啶、5%蛋黃粉、76．3%基礎飼料)，喂養時間分別為3個月、5個月。動脈粥樣硬化組實驗開始時一次性腹腔注射維生素D3針劑6×105IU/kg，并于造模第1周、2周、3周各補充腹腔注射維生素D3針劑1×105IU/kg，動物自由飲水，建立AS大鼠模型。各組大鼠于喂養結束時間點采用20%烏拉坦0．5 mL/100 g腹腔注射全身麻醉，腹主動脈采血后處死，血液儲存于EDTA抗凝管中用于流式細胞術檢測。制作主動脈根部病理切片，用于HE染色及免疫組化實驗。

1．3．2染色及圖像采集主動脈根部標本石蠟包埋，4 μm連續切片。HE染色：常規脫蠟、水化，行HE染色，光鏡下對比觀察各組主動脈根部形態學變化。免疫組化染色：二甲苯脫蠟，系列乙醇浸泡水化，3%過氧化氫室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復2 min，加5%BSA封閉液，37℃孵育30 min。加1∶50稀釋的兔抗人，大鼠，小鼠TNF-α多克隆一抗，4℃過夜。滴加生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育30 min。滴加SABC，室溫孵育30 min。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色程度。使用BI 2000醫學圖像分析系統測定平均灰度值。

1．3．3流式細胞儀(FCM)檢測取1．5 mL EDTA抗凝血，加入1．5 mL PBS液，吹打均勻。取15 mL離心管，加入3 mL淋巴細胞分離液，沿管壁緩慢加入等體積的上述稀釋抗凝血，1 500 r/min離心20 min。用移液器取出第二層環狀乳白色淋巴細胞層，置入新的離心管中，加PBS液吹打均勻后1 000 r/min離心4 min，棄上清。加入Anti-Rat CD4 FITC 1 μL，Anti-Rat CD25 PE 4 μL，室溫避光20 min。加1 mL新鮮配制的固定/破膜液，混勻，4℃避光孵育28 min。加入2 mL新鮮配制的破膜緩沖液，1 000 r/min離心4 min，棄上清。重復一次。加4 μL抗鼠Foxp3 APC，混勻，室溫避光孵育30 min。加入4 mL 破膜緩沖液，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加上機Buffer流式細胞儀分析。

2結果

2．1大鼠主動脈病理變化光鏡下可見A組大鼠主動脈內膜光滑，血管壁無斑塊形成。B1組大鼠主動脈可見隆起于動脈內膜表面的斑塊形成，斑塊表層為纖維結締組織，此為早期斑塊，即纖維斑塊期。B2組大鼠主動脈可見纖維帽下脂質及肌纖維崩解壞死產物增多，為晚期斑塊，即粥樣斑塊期。

2．2免疫組織化學染色結果主動脈TNF-α表達關系：B1組>B2組>A組，B1、B2組與A組差異有統計學意義(P<0．05)，其余各組間差異均無統計學意義，詳見表1。光鏡下A組大鼠主動脈未見明顯TNF-α棕黃色顆粒表達。B1組、B2組大鼠主動脈內皮細胞和平滑肌細胞的胞漿中可見顏色為棕黃色TNF-α陽性顆粒表達，二者表達差異并不明顯。

表1　主動脈TNF-α平均灰度值(±s)

2．3流式細胞儀分析結果B1組大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+T細胞比例低于A組和B2組大鼠(P<0．05)。詳見表2。

表2　大鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性

3討論

Treg可抑制Th1/Th17介導的炎癥反應，以及減弱樹突細胞抗原提呈作用，發揮抗AS作用。根據其來源可分為nTreg和誘導性調節性T細胞(induced regulatory T cell，iTreg)。TNF-α來源廣泛，包括各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等。TNF-α上調被認為是炎癥反應的基準。當TNF-α作用于血管內皮細胞，可導致血管損傷和血栓形成。然而，近年來大量研究表明，TNF可以通過TNFR2受體激活和增加Treg。如有學者發現，在體外，與IL-2協同下，TNF-α可選擇性的激活老鼠 Treg，使其增殖和上調轉錄因子Foxp3的表達，促進其抑制作用[3]。體外利用TNF孵化共培養的Tregs和效應性T細胞(effector T cells，Teffs)，在較短時間(48 h)，可部分逆轉Treg對Teffs的抑制活性。然而經過較長的孵育時間(72 h)，Treg抑制活性恢復[4]。這些數據說明在炎癥反應早期，雖然有Treg的存在，但TNF可降低Treg的抑制活性并促進Teffs增殖。然而，在TNF長期作用下，可恢復功能性Treg活性，并抑制Teffs的增殖。

本研究觀察到在大鼠AS病變早期，外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例降低，而在病變晚期升高并接近于健康對照組大鼠水平。主動脈TNF-α表達在AS病變早期、晚期并沒有顯著差異，均高于健康對照組大鼠。結合以往研究，本實驗認為外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞水平在AS早、晚期階段的變化，可能與TNF-α調節有關。研究表明，雖然TNFR2優先表達于Treg，但一小部分老鼠Teffs(<10%)和人外周血Teffs(約20%)也表達TNFR2，TNFR2在Teffs中的表達可以增強Teffs對Treg介導抑制效應的抵抗[5]。AS病變早期，TNF-α作用下，nTreg對Teffs抑制活性減弱，Teffs增殖，使外周nTreg相對減少[6]。病變晚期，優先表達在Treg上的TNFR2對保留Treg對炎癥反應負反饋調節開始發揮重要作用，nTreg細胞對Teffs抑制活性恢復，外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞比例升高，抑制炎癥進一步發展，體現出機體免疫調節的一種重要負反饋機制。

參考文獻：

[1]Grell M，Becke FM，Wajant H，et al．Tumor necrosis factor (TNF) receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1[J]．European Journal of Immunology，1998，28(1)： 257-263．

[2]Grell M，Douni E，Wajant H，et al．The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor[J]．Cell，1995，83(5)： 793-802．

[3]Miller AM，McPhaden AR，Preston A，et al．TNFα increases the inflammatory response to vascular balloon injury without accelerating neointimal formation[J]．Atherosclerosis，2005，179(1)： 51-59．

[4]Chen X，Oppenheim JJ．TNF-alpha： an activator of CD4+FoxP3+TNFR2+regulatory T cells[J]．Curr Dir Autoimmun，2010，11：119-134．

[5]Chen X，B?umel M，M?nnel DN，et al．Interaction of TNF with TNF receptor type 2 promotes expansion and function of mouse CD4+CD25+T regulatory cells[J]．The Journal of Immunology，2007，179(1)： 154-161．

[6]Chen X，Hamano R，Subleski JJ，et al．Expression of costimulatory TNFR2 induces resistance of CD4+FoxP3 conventional T cells to suppression by CD4+Foxp3+regulatory T cells[J]．The Journal of Immunology，2010，185(1)： 174-182．

(本文編輯王雅潔)

Peripheral Blood Natural Regulatory T Cells and the Expression of TNF-α in Aortas during the Progression of Atherosclerosis

Luo Feitong，Hao Chunyan，Duan Hubin，Teng Pingping，Chen Qing，Yi Qin

The First Clinical school，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Abstract：ObjectiveTo explore the immune regulation effect of peripheral blood natural regulatory T cell(nTreg) and the expression of tumor necrosis factor(TNF)-α in aortas during the progression of atherosclerosis(AS)．Methods Thirty-six male Sprague-Dawley (SD) rats (body weight 100 g±10 g) were randomly divided into，healthy control group (group A)，early stage atherosclerosis group (group B1)，late stage atherosclerosis group (group B2) ，each group had 12 rats．Rat atherosclerosis models were established by treating rats with celiac injection of vitamin D3 accompanied by high sucrose-high fat diet in this experiment．The frequency of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell in peripheral blood was measured by fluorescence-activated cell sorter(FACS)in each group．Aortas were observed with HE staining for pathological changes．The expression of TNF-α in the rat aortic roots was detected by immunohistochemical assay．ResultsThere was no plaque in the rat aortic roots in group A．There was fibrous plague in the rat aortic roots in group B1．There was atheromatous plague in the rat aortic roots in group B2．The expressions of TNF-α protein in the rat aortic roots in group B1 and group B2 wwre higher than those in group A(P<0．05)．Peripheral frequency of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cell was decreased in group B1 compared with those in group A and group B2(P<0．05)．ConclusionThe change of peripheral blood natural regulatory T cell may be associated with the TNF-α adjustment in different periods of atherosclerosis．

Key words：atherosclerosis；tumor necrosis factor α；natural regulatory T cell；rat

基金項目：2015年度山西省研究生教育創新項目(No．2015SY30)，山西醫科大學2012年度博士啟動基金(No．B03201217)；2013年山西省衛生廳科技攻關項目(No．201301068)；2013年度山西醫科大學第一醫院院基金(No．YG1303)

通訊作者：郝春艷，E-mail：13803494928@126．com

中圖分類號：R543R285

文獻標識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．03．013

文章編號：1672-1349(2016)03-0270-03

Corresponding Author：Hao Chunyan

(收稿日期：2015-08-25)