丹參素對HK-2細胞轉分化和凋亡的調控

劉思聰，魏金楓，彭勇碩，王　雪，曲　琦，包新宇，張海濤，欒海艷

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江省 佳木斯 154007)

丹參素對HK-2細胞轉分化和凋亡的調控

劉思聰，魏金楓，彭勇碩，王雪，曲琦，包新宇，張海濤，欒海艷

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江省 佳木斯 154007)

摘要：本文旨在研究丹參素對HK-2細胞轉分化和凋亡的調控及其機制。方法：貼壁培養HK-2細胞于含10%FBS的DMEM培養基中，并將細胞分為N組，H組和D組。N組被培養于含5.5 mmol/L低糖的DMEM培養基中，H組被培養于含25 mmol/L高糖的DMEM培養基中，D組則被培養于含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹參素的DMEM培養基中，作用時間為48 h。實驗結束后，倒置顯微鏡下觀察HK-2細胞形態；免疫組織熒光技術檢測CollagenⅠ、E-cadherin、FN的表達。結果：1.形態變化：N組細胞呈固有的多邊形，胞核也呈固有的橢圓形；而H組絕大多數細胞已失去固有的形態，呈現纖維化改變，且胞核也呈梭形變；但D組大部分細胞仍保持原有的上皮細胞形態，僅少量呈現纖維化改變。2. CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白的表達：對照N組，H組的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而對照H組，D組CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達則明顯下降(P<0.05)，但對照N組，其仍未達到正常表達水平(P<0.05)。結論：丹參素能通過降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表達來減弱高糖對HK-2 細胞的轉分化和凋亡作用。

關鍵詞：丹參素；HK-2細胞；轉分化與凋亡

0引言

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是導致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因，也是一類以進行性腎纖維化為特征的疾病，[1]其腎臟功能的下降與腎間質纖維化和腎小球硬化的關系十分密切。研究表明，無論從發病時間或機制來說，腎小管結構或功能的改變對DN的發生發展均具有重要的影響。因此，本研究擬采用高糖誘導的方法，使HK-2細胞發生轉分化和凋亡，同時給予丹參素(danshensu, DSS)作為藥物干預，觀察其對HK-2細胞轉分化和凋亡的影響，以期為臨床治療糖尿病腎纖維化為特征的疾病提供一個新的治療方案。

1材料與方法

1.1實驗對象及分組

在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內，用含10% 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養基貼壁培養HK-2細胞，待其處于對數生長期后用于后續實驗。

實驗細胞分三組：正常組(N組)；高糖組(H組)；丹參素組(D組)。

1.2給藥方案

N組用含5.5 mmol/L低糖的DMEM培養基培養，H組用含25 mmol/L高糖的DMEM培養基培養，而D組則用含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹參素的DMEM培養基培養，作用時間為48 h。

1.3檢測指標

采用倒置顯微鏡觀察HK-2細胞的形態改變；免疫組織熒光技術檢測CollagenⅠ、E-cadherin、FN蛋白表達的改變。

1.4檢測試劑

丹參素(藥物純度：98.0%，南京澤朗醫藥科技有限公司)；胎牛血清(GIBCO, USA)；DMEM培養基(Hyclone, USA)；CollagenⅠ、E-cadherin和FN(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5統計學分析

2結果

2.1HK-2細胞的形態變化

N組細胞呈現固有的多邊形，胞核也呈現固有的橢圓形；而H組絕大多數細胞已失去其固有的形態，呈現纖維化改變——成纖維細胞樣的長梭形，且胞核也呈梭形變；但D組大部分細胞仍保持原有的上皮細胞形態，僅少量呈現纖維化改變。

2.2CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達

對照N組，H組的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表達明顯升高(P<0.05)；而對照H組，D組CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達則明顯下降(P<0.05)，但對照N組，其仍未達到正常表達水平(P<0.05)。(見圖1)

圖1　CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白在HK-2細胞中的表達情況*N組vs H組，P <0.05；# H組vs D組，P <0.05。

3討論

腎小管間質病變的嚴重程度與DN的腎功能損害密切相關，[2]是反映腎功能下降程度和判斷預后的最重要指標。腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)的發病機制主要是細胞外基質(extracelluar matrix, ECM)的過量分泌、異常沉積，成纖維細胞(Myofibroblast, MyoF)的增生，以及腎小管的萎縮和消失。[3]

腎間質中ECM過度沉積是腎小管間質纖維化的基本病理特征，包括膠原(I、Ⅲ、IV、Ⅴ、VII型)，纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和層粘連蛋白(laminin)。研究表明，在一些病理條件下，腎小管上皮細胞(Tubular Epithelial Cell, TEC)可發生上皮細胞向肌成纖維細胞的轉分化(Tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation, TEMT)，即腎小管上皮細胞喪失其原有的上皮細胞表型特征，而獲得肌成纖維細胞的表型，并大量表達其標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)。TEMT能直接參與腎間質纖維化的進程，是DN腎間質纖維化發生發展的中心環節，[4]且已成為腎纖維化乃至慢性腎功能衰竭的重要機制之一。研究發現，DN患者腎組織中TEMT的多少與間質纖維化的程度顯著關聯，與尿蛋白數量、腎功能下降程度也緊密關聯。通常認為腎間質纖維化的主要特征是出現MyoF，MyoF是腎間質纖維化形成過程中產生ECM的主要效應細胞，是TEMT的關鍵步驟。[5]

此外，腎間質細胞和腎小管細胞過度的增殖與凋亡(apoptosis)也能夠引起腎小管上皮細胞發生萎縮和腎間質纖維化，[3]可造成組織器官的結構和功能異常，甚至喪失，是腎臟重構的啟動因素，[4]凋亡既是腎臟功能損傷的結果，更是腎臟損傷持續的原因。近年來，隨著人們對細胞凋亡的信號轉導、基因調控以及與疾病之間關系的深入研究，發現DN也與細胞凋亡的發生發展關系密切；[5]在DN大鼠的體內和高糖條件下培養的腎小管上皮細胞中都發現，發生凋亡的腎小管上皮細胞數目明顯增多。[6]

丹參作為傳統的中草藥在治療DN的研究中取得了重大突破，已廣泛應用于臨床。研究證實，丹參酮能夠抑制腎間質纖維化來源的成纖維細胞體外增殖，[7]降低大鼠病側腎間質 TGF-β1和α-SMA表達水平，減少炎性細胞浸潤及IV型膠原沉積，減少ECM生成，促進ECM降解保護腎小管的正常結構，延緩腎間質纖維化的發生。[8]丹參素對肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)的生長增殖具有明顯抑制作用，能上調Smad7 mRNA的表達，下調Smad2、Smad3 mRNA的表達，降低α-SMA的表達，抑制HSCs活化。[9]丹參素還能負性調控肝纖維化過程，對TGF-β1引起的HSCs增殖具有明顯抑制作用，拮抗TGF-β引起的BMP受體表達下調，進而影響下游Smad分子。[10]此外，丹參素對TGF-β1/Smad/ERK信號通路也具有抑制效應。[11]本實驗著重選取了丹參的主要水溶性成分之一——丹參素作為我們的研究目標，以期為丹參防治糖尿病腎病提供更有力的理論依據，并提高其利用效率，降低其副作用，更好地發揮祖國傳統醫學的作用。我們的研究顯示，丹參素能抑制高糖對HK-2 細胞的轉分化和凋亡，并且這種調節是通過降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表達來實現的。

參考文獻：

[1]Thorp ML. Diabetic nephropathy: common questions. Am Fam Physician. 2005 Jul 1;72(1):96-9.

[2]Liu Y. Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics. Kidney Int. 2006 Jan;69(2):213-7.

[3]Hills CE, Squires PE. The role of TGF-β and epithelial-to mesenchymal transition in diabetic nephropathy. Cytokine Growth Factor Rev. 2011 Jun;22(3):131-9.

[4]Nangaku M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med. 2004 Jan;43(1):9-17.

[5]Massagué J. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000 Dec;1(3):169-78.

[6]Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S, Danesh FR. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008 Jan;233(1):4-11.

[7]孫興旺, 曹靈, 于國華, 等. 丹參酮-A磺酸鈉對纖維化人腎間質成纖維細胞體外增殖及cyclin E蛋白表達的影響. 第三軍醫大學學報， 2007,29(7):585-7.

[8]唐錦輝, 占成業. 丹參酮Ⅱ-對大鼠腎間質纖維化的抑制作用. 內科急危重癥雜志,2008,14(1):16-8.

[9]戴晴, 李欣, 鄭磊, 董志. 丹參素對肝星狀細胞TGF-β信號轉導的影響. 中國病理生理雜志， 2009;25(10):1988-94.

[10]武鵬宇, 戴立里, 唐靜, 咼琳琳. 丹參素對肝星狀細胞增殖活化及TGF-β/BMP受體表達的影響. 重慶醫科大學學報， 2010;35(9):1344-47.

[11]唐靜, 戴立里, 咼琳琳, 武鵬宇. 肝纖維化中丹參素對TGF-β1/Smads/ERK信號通路的影響及其相互關系. 第三軍醫大學學報，2011;33(11):1159-64.

(編輯馬海超)

The Regulation of Danshensu on the Transdifferentiation and Apoptosis of HK-2 Cells

LIU Sicong, WEI Jinfeng, PENG Yongshuo, WANG Xue, QU Qi, BAO Xinyu, ZHANG Haitao, LUAN Haiyan

(The Department of Basic Medical Sciences in Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Observe the regulation and mechanism of DSS on transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells. Method: Culture HK-2 cells in DMEM medium which contains 10% FBS, and divide the cells into three groups: N, H and D. Group N was cultured in DMEM medium which contained 5.5 mmol/L glucose; group H was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose; group D was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose and 0.2 mg/ml DSS, acting for 48 h. After the experiment, observe the change of HK-2 cells morphology under the inverted microscope; and detect the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN by fluorescence immunohistochemistry. Results: 1. Morphology changes: the cells of group N were polygonal, and the nucleus were oval; most of cells in group H had lost their original forms, showing fibroblast-like fusiform, and the nucleus also changed into fusiform; most cells in group D still remained the original epithelial cell morphology, and only a small amount of cells changed into long fibroblast-like spindle. 2. The expression of CollagenⅠ、E-cadherin and FN: compared with group N, the expressions of CollagenⅠ, E-cadherin and FN in group H were increased significantly (P<0.05); compared with group H, they in group D were decreased significantly (P<0.05), but compared with group N, they had not yet reached normal level (P<0.05). Conclusion: DSS could weak the transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells which were induced by high glucose. And this effect was realized by decreasing the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN.

Keywords：Danshensu; HK-2 cells; transdifferentiation and apoptosis

收稿日期：2016-01-27

基金項目：2014年佳木斯大學大學生科技創新項目(XSYD2014-015)。

作者簡介：劉思聰(1992—),在讀學士。研究方向：糖尿病腎病的研究基金項目。 通訊作者：欒海艷(1979—),女，博士研究生，佳木斯大學基礎醫學院生理教研室，講師，碩士研究生導師。研究方向：糖尿病腎病及其機制的研究。

中圖分類號：R692.6

文獻標識碼：A文章編碼：1672-0601(2016)05-0001-04