丹參素對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的調(diào)控

劉思聰，魏金楓，彭勇碩，王　雪，曲　琦，包新宇，張海濤，欒海艷

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江省 佳木斯 154007)

丹參素對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的調(diào)控

劉思聰，魏金楓，彭勇碩，王雪，曲琦，包新宇，張海濤，欒海艷

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江省 佳木斯 154007)

摘要：本文旨在研究丹參素對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的調(diào)控及其機(jī)制。方法：貼壁培養(yǎng)HK-2細(xì)胞于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞分為N組，H組和D組。N組被培養(yǎng)于含5.5 mmol/L低糖的DMEM培養(yǎng)基中，H組被培養(yǎng)于含25 mmol/L高糖的DMEM培養(yǎng)基中，D組則被培養(yǎng)于含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹參素的DMEM培養(yǎng)基中，作用時(shí)間為48 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，倒置顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)；免疫組織熒光技術(shù)檢測(cè)CollagenⅠ、E-cadherin、FN的表達(dá)。結(jié)果：1.形態(tài)變化：N組細(xì)胞呈固有的多邊形，胞核也呈固有的橢圓形；而H組絕大多數(shù)細(xì)胞已失去固有的形態(tài)，呈現(xiàn)纖維化改變，且胞核也呈梭形變；但D組大部分細(xì)胞仍保持原有的上皮細(xì)胞形態(tài)，僅少量呈現(xiàn)纖維化改變。2. CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白的表達(dá)：對(duì)照N組，H組的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而對(duì)照H組，D組CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達(dá)則明顯下降(P<0.05)，但對(duì)照N組，其仍未達(dá)到正常表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)論：丹參素能通過降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表達(dá)來減弱高糖對(duì)HK-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和凋亡作用。

關(guān)鍵詞：丹參素；HK-2細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化與凋亡

0引言

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)的主要原因，也是一類以進(jìn)行性腎纖維化為特征的疾病，[1]其腎臟功能的下降與腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化的關(guān)系十分密切。研究表明，無論從發(fā)病時(shí)間或機(jī)制來說，腎小管結(jié)構(gòu)或功能的改變對(duì)DN的發(fā)生發(fā)展均具有重要的影響。因此，本研究擬采用高糖誘導(dǎo)的方法，使HK-2細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化和凋亡，同時(shí)給予丹參素(danshensu, DSS)作為藥物干預(yù)，觀察其對(duì)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的影響，以期為臨床治療糖尿病腎纖維化為特征的疾病提供一個(gè)新的治療方案。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10% 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，待其處于對(duì)數(shù)生長期后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分三組：正常組(N組)；高糖組(H組)；丹參素組(D組)。

1.2給藥方案

N組用含5.5 mmol/L低糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，H組用含25 mmol/L高糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，而D組則用含25 mmol/L高糖和0.2 mg/ml丹參素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用時(shí)間為48 h。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

采用倒置顯微鏡觀察HK-2細(xì)胞的形態(tài)改變；免疫組織熒光技術(shù)檢測(cè)CollagenⅠ、E-cadherin、FN蛋白表達(dá)的改變。

1.4檢測(cè)試劑

丹參素(藥物純度：98.0%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；胎牛血清(GIBCO, USA)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone, USA)；CollagenⅠ、E-cadherin和FN(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1HK-2細(xì)胞的形態(tài)變化

N組細(xì)胞呈現(xiàn)固有的多邊形，胞核也呈現(xiàn)固有的橢圓形；而H組絕大多數(shù)細(xì)胞已失去其固有的形態(tài)，呈現(xiàn)纖維化改變——成纖維細(xì)胞樣的長梭形，且胞核也呈梭形變；但D組大部分細(xì)胞仍保持原有的上皮細(xì)胞形態(tài)，僅少量呈現(xiàn)纖維化改變。

2.2CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達(dá)

對(duì)照N組，H組的CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；而對(duì)照H組，D組CollagenⅠ、E-cadherin和FN的蛋白表達(dá)則明顯下降(P<0.05)，但對(duì)照N組，其仍未達(dá)到正常表達(dá)水平(P<0.05)。(見圖1)

圖1　CollagenⅠ、E-cadherin和FN蛋白在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)情況*N組vs H組，P <0.05；# H組vs D組，P <0.05。

3討論

腎小管間質(zhì)病變的嚴(yán)重程度與DN的腎功能損害密切相關(guān)，[2]是反映腎功能下降程度和判斷預(yù)后的最重要指標(biāo)。腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)的發(fā)病機(jī)制主要是細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix, ECM)的過量分泌、異常沉積，成纖維細(xì)胞(Myofibroblast, MyoF)的增生，以及腎小管的萎縮和消失。[3]

腎間質(zhì)中ECM過度沉積是腎小管間質(zhì)纖維化的基本病理特征，包括膠原(I、Ⅲ、IV、Ⅴ、VII型)，纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和層粘連蛋白(laminin)。研究表明，在一些病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞(Tubular Epithelial Cell, TEC)可發(fā)生上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(Tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation, TEMT)，即腎小管上皮細(xì)胞喪失其原有的上皮細(xì)胞表型特征，而獲得肌成纖維細(xì)胞的表型，并大量表達(dá)其標(biāo)志性蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)。TEMT能直接參與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，是DN腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，[4]且已成為腎纖維化乃至慢性腎功能衰竭的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎組織中TEMT的多少與間質(zhì)纖維化的程度顯著關(guān)聯(lián)，與尿蛋白數(shù)量、腎功能下降程度也緊密關(guān)聯(lián)。通常認(rèn)為腎間質(zhì)纖維化的主要特征是出現(xiàn)MyoF，MyoF是腎間質(zhì)纖維化形成過程中產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞，是TEMT的關(guān)鍵步驟。[5]

此外，腎間質(zhì)細(xì)胞和腎小管細(xì)胞過度的增殖與凋亡(apoptosis)也能夠引起腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生萎縮和腎間質(zhì)纖維化，[3]可造成組織器官的結(jié)構(gòu)和功能異常，甚至喪失，是腎臟重構(gòu)的啟動(dòng)因素，[4]凋亡既是腎臟功能損傷的結(jié)果，更是腎臟損傷持續(xù)的原因。近年來，隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控以及與疾病之間關(guān)系的深入研究，發(fā)現(xiàn)DN也與細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；[5]在DN大鼠的體內(nèi)和高糖條件下培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)，發(fā)生凋亡的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多。[6]

丹參作為傳統(tǒng)的中草藥在治療DN的研究中取得了重大突破，已廣泛應(yīng)用于臨床。研究證實(shí)，丹參酮能夠抑制腎間質(zhì)纖維化來源的成纖維細(xì)胞體外增殖，[7]降低大鼠病側(cè)腎間質(zhì) TGF-β1和α-SMA表達(dá)水平，減少炎性細(xì)胞浸潤及IV型膠原沉積，減少ECM生成，促進(jìn)ECM降解保護(hù)腎小管的正常結(jié)構(gòu)，延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。[8]丹參素對(duì)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的生長增殖具有明顯抑制作用，能上調(diào)Smad7 mRNA的表達(dá)，下調(diào)Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)，降低α-SMA的表達(dá)，抑制HSCs活化。[9]丹參素還能負(fù)性調(diào)控肝纖維化過程，對(duì)TGF-β1引起的HSCs增殖具有明顯抑制作用，拮抗TGF-β引起的BMP受體表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響下游Smad分子。[10]此外，丹參素對(duì)TGF-β1/Smad/ERK信號(hào)通路也具有抑制效應(yīng)。[11]本實(shí)驗(yàn)著重選取了丹參的主要水溶性成分之一——丹參素作為我們的研究目標(biāo)，以期為丹參防治糖尿病腎病提供更有力的理論依據(jù)，并提高其利用效率，降低其副作用，更好地發(fā)揮祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的作用。我們的研究顯示，丹參素能抑制高糖對(duì)HK-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和凋亡，并且這種調(diào)節(jié)是通過降低CollagenⅠ、E-cadherin和FN的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Thorp ML. Diabetic nephropathy: common questions. Am Fam Physician. 2005 Jul 1;72(1):96-9.

[2]Liu Y. Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics. Kidney Int. 2006 Jan;69(2):213-7.

[3]Hills CE, Squires PE. The role of TGF-β and epithelial-to mesenchymal transition in diabetic nephropathy. Cytokine Growth Factor Rev. 2011 Jun;22(3):131-9.

[4]Nangaku M. Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney: final common pathways to end-stage renal failure. Intern Med. 2004 Jan;43(1):9-17.

[5]Massagué J. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000 Dec;1(3):169-78.

[6]Kanwar YS, Wada J, Sun L, Xie P, Wallner EI, Chen S, Chugh S, Danesh FR. Diabetic nephropathy: mechanisms of renal disease progression. Exp Biol Med (Maywood). 2008 Jan;233(1):4-11.

[7]孫興旺, 曹靈, 于國華, 等. 丹參酮-A磺酸鈉對(duì)纖維化人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞體外增殖及cyclin E蛋白表達(dá)的影響. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007,29(7):585-7.

[8]唐錦輝, 占成業(yè). 丹參酮Ⅱ-對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的抑制作用. 內(nèi)科急危重癥雜志,2008,14(1):16-8.

[9]戴晴, 李欣, 鄭磊, 董志. 丹參素對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響. 中國病理生理雜志， 2009;25(10):1988-94.

[10]武鵬宇, 戴立里, 唐靜, 咼琳琳. 丹參素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖活化及TGF-β/BMP受體表達(dá)的影響. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010;35(9):1344-47.

[11]唐靜, 戴立里, 咼琳琳, 武鵬宇. 肝纖維化中丹參素對(duì)TGF-β1/Smads/ERK信號(hào)通路的影響及其相互關(guān)系. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011;33(11):1159-64.

(編輯馬海超)

The Regulation of Danshensu on the Transdifferentiation and Apoptosis of HK-2 Cells

LIU Sicong, WEI Jinfeng, PENG Yongshuo, WANG Xue, QU Qi, BAO Xinyu, ZHANG Haitao, LUAN Haiyan

(The Department of Basic Medical Sciences in Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Abstract：Observe the regulation and mechanism of DSS on transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells. Method: Culture HK-2 cells in DMEM medium which contains 10% FBS, and divide the cells into three groups: N, H and D. Group N was cultured in DMEM medium which contained 5.5 mmol/L glucose; group H was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose; group D was cultured in DMEM medium which contained 25 mmol/L glucose and 0.2 mg/ml DSS, acting for 48 h. After the experiment, observe the change of HK-2 cells morphology under the inverted microscope; and detect the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN by fluorescence immunohistochemistry. Results: 1. Morphology changes: the cells of group N were polygonal, and the nucleus were oval; most of cells in group H had lost their original forms, showing fibroblast-like fusiform, and the nucleus also changed into fusiform; most cells in group D still remained the original epithelial cell morphology, and only a small amount of cells changed into long fibroblast-like spindle. 2. The expression of CollagenⅠ、E-cadherin and FN: compared with group N, the expressions of CollagenⅠ, E-cadherin and FN in group H were increased significantly (P<0.05); compared with group H, they in group D were decreased significantly (P<0.05), but compared with group N, they had not yet reached normal level (P<0.05). Conclusion: DSS could weak the transdifferentiation and apoptosis of HK-2 cells which were induced by high glucose. And this effect was realized by decreasing the expressions of CollagenⅠ、E-cadherin and FN.

Keywords：Danshensu; HK-2 cells; transdifferentiation and apoptosis

收稿日期：2016-01-27

基金項(xiàng)目：2014年佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(XSYD2014-015)。

作者簡(jiǎn)介：劉思聰(1992—),在讀學(xué)士。研究方向：糖尿病腎病的研究基金項(xiàng)目。 通訊作者：欒海艷(1979—),女，博士研究生，佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，講師，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：糖尿病腎病及其機(jī)制的研究。

中圖分類號(hào)：R692.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編碼：1672-0601(2016)05-0001-04