iNOS抑制劑1400W對人舌鱗癌CAL-27細胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭衛衛 祝偉 鄧江華 李勇 黃新幫 鄧建鴻

iNOS抑制劑1400W對人舌鱗癌CAL-27細胞株黏附力的研究

何海蕾 王羽 郭小青 彭衛衛 祝偉 鄧江華 李勇 黃新幫 鄧建鴻

目的 探討缺氧條件培養下誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抑制劑1400W對人舌鱗癌CAL-27細胞株黏附能力的影響。方法 MTT法檢測1400W對人舌鱗狀癌細胞CAL-27黏附能力的影響。結果 細胞黏附率與對照組比較明顯下降(P＜0.05)。1400W作用于人舌鱗癌CAL-27細胞后，可呈時間、劑量性依賴抑制人舌鱗癌黏附能力(P＜0.05)。結論 1400W可明顯抑制人舌鱗癌的黏附能力。1400W對人舌鱗狀細胞癌生長、侵襲、轉移具有預防和潛在的治療價值。

人舌鱗癌；1400W；黏附力

舌鱗癌為最常見的嚴重危害性口腔癌之一，多呈浸潤生長，常累及舌根、舌腹、舌根、咽側壁、口底等區域，頸部復發易累及Ⅰ、Ⅱ區，極罕見的情況可累及腮腺，甚至轉移至其他部位，其預后很差，疼痛潰爛嚴重影響患者吞咽言語，直至影響生命，患者后期非常痛苦[1]。與癌進展關系密切的是誘導型一氧化氮合酶（iNOS），因此抑制一氧化氮合酶的活性及作用是可行性方案[2]。本研究給予不同濃度的1400W作用相應時間，觀察其對舌鱗癌細胞黏附力的情況進而研究抑制腫瘤的可能性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 細胞培養條件 讓人舌鱗癌CAL-27細胞株培養于正常濕度37℃、95%氮氣和5%CO2缺氧條件下用含10%新生牛血清的培養液培養成細胞懸液，設立實驗組及對照組。預實驗初步篩選出最佳濃度及時間（200μmol/L、90min）。

1.2 MTT法檢測1400W 對人舌鱗癌細胞CAL-27黏附能力的影響 實驗組加相應1400W濃度，對照組加等體積DMEM液。設定實驗組和對照組。MTT法檢測1400W：對人舌鱗癌細胞CAL-27黏附能力的影響，將相應1400W濃度作用于實驗組，加等體積DMEM液于對照組。各組在37℃缺氧條件下培養相應時間，用含10%新生牛血清的培養液配成單個細胞懸液，再將各組分別以0.1%胰蛋白酶消化，配成濃度為1×105/mL的細胞懸液，取200μL入96孔每孔培養板中，每孔8×103～10×103個細胞，再加用人工基膜Matrigel（用DMEM稀釋的）10μL于每孔常規培養，待成膠后先予紫外光消毒滅菌，每組設4個平行孔，重復3次。4個平行孔于作用30、60、90、120min各時間點分別取出各組培養液及懸浮細胞，繼續加入無血清的DMEM200μL培養，取20μL MTT培養4h，加二甲亞砜(DMSO)200μL，震蕩2min取出進行黏附能力的測定。在以空白孔調零，經酶聯免疫檢測儀在波長490nm下測定每個OD值。細胞黏附率=（處理組平均OD值/對照組平均OD值）× 100%。黏附抑制率=[1-（處理組平均OD值/對照組平均OD值）]×100%。所有實驗重復3次，計算平均抑制率。

1.3 觀察指標 研究相同濃度的1400W對人舌鱗癌細胞作用不同時間黏附抑制率，證明其呈作用時間依賴性能抑制腫瘤異質性黏附能力及研究不同濃度1400W對人舌鱗癌細胞作用相同時間黏附抑制率的抑制，證明其呈劑量依賴性能抑制腫瘤異質性黏附能力。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 200μmol/L的1400W作用不同時間對人舌鱗癌細胞抑制率的影響 200μmol/L1400W作用30、60、90、120min，各時間組人舌鱗癌CAL-27黏附抑制率與相應對照組比較有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.05)。黏附抑制率分別為14%、19%、24%、31%，1400W可呈時間依賴性抑制人舌鱗癌黏附能力。

表1 用200μmol/L的1400W作用不同時間對人舌鱗癌細胞抑制率的影響（x±s，%）

2.2 不同濃度1400W作用90min對人舌鱗癌細胞胞抑制率的影響 用50、100、200、400μmol/L濃度1400W處理90min后，各濃度組舌鱗癌CAL-27黏附率與相應對照組比較有明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。黏附抑制率分別為16%、20%、24%、30%，1400W可呈劑量依賴性抑制人舌鱗癌黏附能力。

表2 不同濃度1400W作用90min對人舌鱗癌細胞胞抑制率的影響（x±s，%）

3 討論

細胞的黏附能力在維持細胞外形、調節細胞分裂、運動等功能中起重要作用。異質性黏附能力是腫瘤發生浸潤的始動步驟，其黏附力的提高導致腫瘤細胞突破基底膜這一機械屏障脫離原發灶并黏附至鄰近組織。舌癌的浸潤轉移即是一個由黏附起始的復雜的病理過程[3]：其中異質黏附力是惡性腫瘤浸潤和轉移的關鍵環節。故用MMT法檢測其黏附能力是有效的方法。研究已證明，MMP-9能加強腫瘤細胞粘黏附力構成瘤細胞移動的通道，最終導致腫瘤的侵襲和轉移。而iNOS與MMP-9具有高度協同作用[4-5]，其產生的NO可通過作用于MMP-9調節血管生成，從而影響腫瘤浸襲和轉移[6]。本研究前期研究已證實1400W對iNOS與MMP-9在舌鱗癌的表達有明顯抑制作用，可呈時間、劑量性依賴。

本研究在缺氧條件培養下培養模擬腫瘤生長的缺氧環境，對不同濃度1400W作用不同時間干預后檢測不同濃度1400w作用不同時間后黏附能力的影響，發現在一定范圍內隨著濃度的增加和時間的延長，腫瘤黏附能力逐漸降低，即1400W對其的黏附抑制率越高，以200μmol/L抑制最為明顯。由實驗可知1400W對舌鱗癌黏附能力，具有抑制作用。

1400W是目前為止最有效的iNOS抑制劑[7]。目前已有1400W抑制其他腫瘤組織的研究[8-11]，但1400W對舌鱗癌細胞作用及影響少見報道。本研究用不同濃度1400W作用不同時間干預舌癌細胞后用MTT法檢測代表腫瘤的黏附能力的相關性，發現隨著濃度的增加和時間的延長舌鱗癌CAL-27細胞黏附力逐漸降低。提示1400W作用于人舌鱗癌CAL-27細胞后，發揮抑瘤作用并且可呈時間、劑量性依賴抑制人舌鱗癌黏附能力，對舌鱗癌的黏附浸潤具有明顯阻止的影響，為1400W應用于臨床控制舌癌的進展提供了新的思路。

[1] 李鴻藝，翦新春.舌癌復發的危險因素分析及其侵犯范圍研究[D].長沙：中南大學，2011.

[2] Itatsu K,Zen Y,Yamaguchi J,et al.Expression of matrix metalloproteinase 7 is an unfavorable postoperative prognostic factor in cholangiocarcinoma of the perihilar,hilar,and extrahepatic bile ducts[J].Hum Pathol，2008,39（5）：710-719.

[3] Jerome Gross.How tadpoles lose their tail：path to discovery of the first matrix metallo-proteinase[J].Matrix Biology,2004,23：3-13.

[4] Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[J].Cancer Metastasis Rev,2006，25（1）：9-34.

[5] Sun MH,Han XC,Jia MK,et al.Expression of inducible nitric oxide synthase and matrix metallop roteimase-9 and their effets on angiogenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol, 2005，11(38)：5931-5937.

[6] 張秀靜，王心彧，張國梁，等.植物乳桿菌代謝產物和Ca2+誘導人舌鱗癌CAL-27細胞凋亡的研究[J].黑龍江醫藥科學，2013，36(2)：16-17.

[7] 葉君，成雁，陳亞萍.INOS抑制劑1400W通過P53途徑增強順鉑對宮頸癌SiHa細胞的化療效果[J].中國細胞生物學學報，2015，37（4）：522-528.

[8] 邢宏松，黃長文，傅華群，等．選擇性iNOS抑制劑1400W對缺氧培養人肝癌SMMC27721細胞株iNOS和VEGF表達的影響[J]．實用臨床醫學，2008，9(9)：3-6.

[9] 葉君，孫紅.iNOS抑制劑1400W宮頸癌Hela細胞株生長的抑制作用[J].復旦學報（醫學版），2009，36(2)：177-181.

[10] 吳京蔓，吳勇.舌鱗癌Cal27裸鼠移植瘤模型的建立及其意義[J].昆明醫科大學學報，2015，36（5）：5-7.

[11] 張海霞，胡春宏，劉歐勝，等.誘導性一氧化氮抑制劑對鼻咽癌CNE-2細胞株作用的探討[J].中國現代醫學雜志，2011，21（18）：2090-2096.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.28.013

市科技局立項編號（GZ2014ZSF229）

江西 341000 贛州市人民醫院口腔頜面外科 （何海蕾 王羽李勇 黃新幫 鄧建鴻） 贛州市人民醫院腫瘤科 （郭小青 彭衛衛 鄧江華）贛州市人民醫院實驗室（祝偉）