鹽酸莫西沙星眼用殼聚糖納米粒溫度敏感原位凝膠的制備與評價

陳驪媛，馬麗芳，鐘守國

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

鹽酸莫西沙星眼用殼聚糖納米粒溫度敏感原位凝膠的制備與評價

陳驪媛1，馬麗芳2，鐘守國3

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

目的 考察離子交聯(lián)法制備鹽酸莫西沙星眼用殼聚糖納米粒溫度敏感原位凝膠的效果。方法 以泊洛沙姆407和188為溫敏基質(zhì)，采用離子交聯(lián)法制備鹽酸莫西沙星眼用殼聚糖納米粒，檢測該納米粒形態(tài)，測定其粒徑、zeta電位和包封率，利用Poloxamer 407 and Poloxamer 188將該納米粒制成溫敏原位凝膠。結(jié)果 掃描電鏡圖顯示納米粒球形度良好，平均粒徑(207.2±6.9)nm(PDI=0.157±0.030)，zeta電位(32.1±1.5)mV，包封率(41.6±1.7)%。結(jié)論 離子交聯(lián)法制備鹽酸莫西沙星眼用殼聚糖納米粒溫敏原位凝膠具有良好的凝膠特性及緩釋效果，藥物釋放機制符合Korsmeyer-Peppas方程。

眼用原位凝膠；溫度敏感；納米粒；鹽酸莫西沙星；體外釋放

普通滴眼液在眼內(nèi)殘留少，需頻繁滴藥，原位凝膠能增加藥物眼內(nèi)滯留，減少滴眼次數(shù)，又無眼膏劑油膩感[1，2]。納米載藥系統(tǒng)具有增加藥物粘附性、延緩藥物釋放，通過內(nèi)吞機制被角膜和結(jié)膜吸收等特點，可有效提高藥物在眼部的生物利用度[3，4]。殼聚糖作為天然高分子陽離子聚合物，是常用的藥物載體材料。殼聚糖載藥納米粒可延緩藥物釋放，提高藥物在眼部的生物利用度，增加眼用原位凝膠的膠凝特性[5，6]。為提高藥物在眼部的生物利用度，延長藥物的作用時間，改善膠凝。本研究以鹽酸莫西沙星為模型藥物，先制備鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒，再應(yīng)用溫度敏感型高分子材料作為原位凝膠基質(zhì)，制備鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒眼用溫度敏感原位凝膠。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料 JY系列電子天平(上海方瑞儀器有限公司)；DF-101 S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；TGL-16離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；PHBJ-260便攜式pH 計(上海精科儀器廠)，LC-20 Atvp高效液相色譜儀(日本島津)，ZEN3690納米粒度儀(馬爾文儀器公司)；S-4800掃描電鏡(日本日立)；KXS恒溫水浴鍋(上海科析試驗儀器廠)；NDJ-1旋轉(zhuǎn)粘度計(上海地學(xué)儀器研究所)；鹽酸莫西沙星(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，含量99.97%)，殼聚糖(CTS，≥99.0%)，天津富宇精細(xì)化工有限公司；三聚磷酸鈉、冰醋酸，≥99.5%，天津博迪化工有限公司；卡波姆980 NF(上海運宏化工有限公司)；泊洛沙姆-407、泊洛沙姆-188(德國BASF)；HPMC-K4 M(陶氏化學(xué))；透析袋(透過分子量1000D，上海綠鳥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒的制備 參考市售制劑，溫度敏感眼用凝膠中的鹽酸莫西沙星的濃度定為0.5%。采用離子交聯(lián)法制備納米粒[6]。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml 濃度的殼聚糖溶液，緩慢滴加1%的三聚磷酸鈉(TPP)溶液，分別以攪拌速度500、600、700、800、900、1000 rpm，以及交聯(lián)時間50、70、80、90、100、120 min，觀察其交聯(lián)狀態(tài)，并測納米球粒徑。

1.2.2 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒形態(tài)與粒徑的測定 將鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒混懸液稀釋，取適量溶液自然干燥后噴金，通過掃描電鏡(SEM)對納米粒進(jìn)行觀察。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(250×4.6 mm 5 μm，Dikma Diamonsil)；流動相為甲醇-水溶液(22.5︰77.5)，水中含0.5 g/L硫酸四丁基銨、1.0 g/L磷酸二氫鉀、3.4 g/L磷酸；柱溫30 ℃，流速1 ml/min，檢測波長293 nm。

1.2.4 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒包封率(EE)的測定 采用低溫超速離心法[7]將納米粒與溶液進(jìn)行分離后，分別測定上清液和納米混懸液中總的藥物量。精密稱取制備的鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒混懸液2.0 g，置高速冷凍離心機中，于4 ℃下20000 rpm離心30 min，分離載藥納米粒，上清液用流動相定容至25 ml，0.45 μm濾膜過濾，測定上清液中鹽酸莫西沙星濃度，標(biāo)記為Cfree。鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒混懸液中加入的藥物濃度，標(biāo)記為Ctotal。

1.2.5 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒溫敏型原位凝膠的制備 ①處方設(shè)計[5]：溫度敏感基質(zhì)選擇泊洛沙姆P407和P188，泊洛沙姆P407設(shè)計考察18%、20%、22% 3個濃度，泊洛沙姆P188設(shè)計考察4%、5%、6% 3個濃度。② 膠凝溫度的測定：采用“攪拌子法”[6]測定膠凝溫度。將適量凝膠基質(zhì)溶液加至西林瓶中，置于恒溫水浴磁力攪拌器上，轉(zhuǎn)速為150 rpm，以0.5 ℃/min的速率緩慢升溫，以磁力攪拌子不再轉(zhuǎn)動時的溫度作為膠凝溫度。③ 處方篩選：采用冷溶法[9]配液。將“1.2.1”項下制備的鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒置于冰箱中，4 ℃下冷藏1 h，取出后攪拌下分別緩慢加入泊洛沙姆P407和P188，繼續(xù)攪拌至分散均勻，冰箱中4 ℃下貯存24 h以上，使泊洛沙姆完全溶解，形成半透明的鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒溫敏型原位凝膠溶液。按“1.2.4”中設(shè)計的泊洛沙姆P407和P188的用量進(jìn)行篩選。評價標(biāo)準(zhǔn)為淚液稀釋前后的膠凝溫度，分別以T1和T2表示，每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.2.6 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒溫敏型原位凝膠體外釋放[9，10]行為測定 精密量取鹽酸莫西沙星水溶液、鹽酸莫西沙星溫敏原位凝膠、鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒、鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒溫敏原位凝膠各2 ml，分別置透析袋中，將透析袋置100 ml模擬淚液中，水浴溫度(33±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速100 rpm下，分別在0.5、1、2、4、6、8取透析袋外溶液1 ml，并補充等量同溫度模擬淚液，取出的溶液稀釋后用“1.2.3”色譜條件中的方法測定其中鹽酸莫西沙星濃度，計算累積釋放度。

1.3 藥品包封率(EE)的計算[5]EE=(1-Cfree/ Ctotal)×100%。平行測定三次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖(CTS)的濃度、轉(zhuǎn)速、交聯(lián)時間對納米粒粒徑的影響 隨著殼聚糖濃度的增加，懸浮液中納米球的平均粒徑逐漸增大。當(dāng)殼聚糖濃度為1～2 mg/ml時，制備的納米粒粒徑約200 nm，且工藝穩(wěn)定，因此，殼聚糖濃度選擇1.5 mg/ml。當(dāng)攪拌速度較低或較高時，其形成的納米球粒徑均較大。當(dāng)攪拌速度為800 rpm時，粒徑最小(220 nm)。當(dāng)交聯(lián)時間較短時，交聯(lián)聚合尚未充分完成，形成的納米粒粒徑較大。當(dāng)交聯(lián)時間大于80 min后，粒徑大幅度增大，當(dāng)交聯(lián)時間在80 min時，粒徑最小。

2.2 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒形態(tài)、粒徑與EE的測定 制備的納米粒球型度良好，見圖1。納米粒的粒徑由馬爾文粒度儀測定，主要分布在100～300 nm，平均粒徑(207.2±6.9) nm，多分散指數(shù)(PDI)為(0.157±0.030)，zeta電位為(32.1±1.5) mV。表明所制納米粒粒徑分布均勻，穩(wěn)定性好，符合眼用要求。EE=(41.6±1.7)%。

圖1 鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒的掃描電鏡圖

2.3 處方設(shè)計結(jié)果 當(dāng)P407含量為18%時，經(jīng)淚液稀釋后的溫度均大于35 ℃，不滿足眼用原位凝膠的要求；當(dāng)P407含量20%和22%，P188的含量4%和5%時，經(jīng)淚液稀釋前的溫度小于30 ℃，淚液稀釋后的溫度均小于35 ℃，但當(dāng)泊洛沙姆P407含量大于20%時，凝膠基質(zhì)對眼部有輕微刺激，故選擇P407含量20%；當(dāng)P188的含量4%時淚液稀釋前的溫度偏低，不利于貯存，故P188的含量選擇5%，見表1。

表1 不同泊洛沙姆組成對膠凝溫度的影響 ( ℃)

2.4 體外藥物釋放曲線 鹽酸莫西沙星溶液中藥物快速釋放，0.5 h已達(dá)77.2%，2 h時就幾乎釋放完全。鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒在最初1 h有突釋現(xiàn)象，可能是由于納米粒混懸液中未包封和吸附在納米粒表面的藥物造成的，之后其藥物釋放速度變緩，釋放趨勢逐漸與納米粒溫敏凝膠接近，緩釋現(xiàn)象明顯。而溫敏凝膠未觀察到明顯突釋現(xiàn)象，溫敏凝膠在2 h前的釋放速度低于納米粒混懸液，之后釋放速度逐漸超過納米粒混懸液，但仍明顯低于藥物溶液，顯示明顯緩釋現(xiàn)象。納米粒溫敏凝膠與溫敏凝膠相同，未觀察到明顯突釋現(xiàn)象，緩釋作用最明顯。見圖2。

圖2 鹽酸莫西沙星4種制劑的體外釋放曲線(n=3)

3 討論

鹽酸莫西沙星是由拜耳公司開發(fā)的第四代新型氟喹諾酮抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒副反應(yīng)小的特點，鹽酸莫西沙星滴眼液(0.5%，3 ml/瓶)是由愛爾康公司(Alcon)開發(fā)的，于2003年獲FDA批準(zhǔn)用于細(xì)菌性結(jié)膜炎。但普通滴眼液在眼內(nèi)殘留少，需頻繁滴藥，為了增加藥物在角膜的滯留時間，減少給藥次數(shù)，目前已有鹽酸莫西沙星溫敏性及離子-溫度雙敏原位凝膠的報道[7，8]。鑒于納米載藥系統(tǒng)具有增加藥物粘附性、延緩藥物釋放，通過內(nèi)吞機制被角膜和結(jié)膜吸收等特點，有效提高藥物在眼部的生物利用度的特點，殼聚糖具有優(yōu)良的生物兼容性和生物粘附性，使納米粒易于粘附于角膜。本研究將鹽酸莫西沙星制成殼聚糖納米粒，再制成溫敏凝膠，目前該研究尚無文獻(xiàn)報道。

殼聚糖納米粒的制備有很多方法[9]，實驗采用離子交聯(lián)法，經(jīng)過殼聚糖的濃度、轉(zhuǎn)速和交聯(lián)時間的篩選，優(yōu)化了制備工藝。在制備過程中發(fā)現(xiàn)，隨著殼聚糖濃度的增大，當(dāng)三聚磷酸鈉溶液滴加到其中時，過量的殼聚糖分子會和少量三聚磷酸鈉分子互相交聯(lián)，使得單個三聚磷酸鈉分子交聯(lián)多個殼聚糖分子，使粒徑增大。當(dāng)殼聚糖濃度低于1 mg/ml，制得的納米粒粒度雖較小，但分布較寬，工藝不夠穩(wěn)定；而殼聚糖濃度為3.0 mg/ml時，平均粒徑接近500 nm；當(dāng)殼聚糖濃度為1～2 mg/ml 時，制備的納米粒粒徑約200 nm，且工藝穩(wěn)定。當(dāng)攪拌速度較低時，滴加到殼聚糖溶液中的三聚磷酸鈉溶液未能及時充分分散，使三聚磷酸鈉局部相對過量，引起過多的凝聚現(xiàn)象，導(dǎo)致納米粒粒徑較大。當(dāng)攪拌速度增加，三聚磷酸鈉溶液分散均勻，粒徑減小。而當(dāng)轉(zhuǎn)速大于800 rpm時，粒徑又逐漸增大，可能是高轉(zhuǎn)速使部分納米粒的結(jié)構(gòu)破壞發(fā)生團(tuán)聚，增大了納米粒的粒徑。當(dāng)交聯(lián)時間在80 min時，粒徑最小。當(dāng)交聯(lián)時間較短時，交聯(lián)聚合尚未充分完成，形成的納米粒粒徑較大。當(dāng)交聯(lián)時間大于80 min后，粒徑大幅度增大，可能由于隨著時間的延長，在攪拌下已形成的納米粒發(fā)生相互凝聚所致。根據(jù)最優(yōu)制備工藝制備了載鹽酸莫西沙星的殼聚糖納米粒，納米粒包封率41.6%，zeta電位32.1 mV，平均粒徑200～300 nm，符合眼用要求。

選擇生物兼容性好、溫敏特點突出的泊洛沙姆P407和P188作為溫敏凝膠基質(zhì)，研究兩者的配比對膠凝溫度的影響[10]。眼內(nèi)溫度大約在34～35 ℃，因此理想的溫度敏感型凝膠基質(zhì)應(yīng)在室溫條件下(25～30 ℃)是自由流動的液體，在34～35 ℃發(fā)生相變[11]。溫度敏感型凝膠基質(zhì)常用泊洛沙姆P407，若單獨使用濃度需大于25%才能滿足眼用原位凝膠的要求，但泊洛沙姆P407濃度超過20%時對眼睛有輕度刺激，故通常和其他泊洛沙姆(常用泊洛沙姆P188)以一定配比復(fù)合使用。結(jié)果顯示當(dāng)P407 的濃度增加，膠凝溫度降低；P188濃度增加時，膠凝溫度增加，優(yōu)選了兩者的配比，制備了鹽酸莫西沙星殼聚糖納米粒的溫敏型原位凝膠，淚液稀釋前后的溫度分別為28.5 ℃和34.4 ℃，滿足貯存和眼部使用的需要。體外釋放試驗結(jié)果顯示，納米粒-溫敏凝膠復(fù)合制劑比單用殼聚糖納米粒或溫敏凝膠使藥物在眼部的滯留時間更長，且有明顯的緩釋效果。該研究為進(jìn)一步開發(fā)新型眼部給藥系統(tǒng)提供一定參考。

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Preparation and evaluation of thermosensitive in situ gel containing moxifloxacin hydrochloride chitosan nanoparticle for ophthalmic use

CHEN Li-yuan1，MA LI-fang2，ZHONG Shou-guo3

(1.College of Clinical Medicine，Southwest Medical University，LuZhou 646000，China； 2.College of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China； 3.Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital，Chengdu 610072，China)

ZHONGShou-guo

Objective To prepare thermosensitive in situ gel containing moxifloxacin hydrochloride chitosan nanoparticle for ophthalmic use.Methods The moxifloxacin hydrochloride chitosan nanoparticles were prepared by using the ionotropic gelation method.The morphology of the nanoparticles was observed.The diameter，zeta potential and entrapment efficiency of the nanoparticles were measured.The in situ gel loaded with moxifloxacin hydrochloride chitosan nanoparticle for ophthalmic use was prepared with Poloxamer 407 and Poloxamer 188 as temperature sensitive matrices.The formulation of gel was optimized.The in vitro release characteristics of the gel were investigated.Results The scanning electron microscope image demonstrated that the nanoparticles were well dispersed as individual particles with a regular spherical shape.The mean diameter was (207.2 ± 6.9) nm (PDI = 0.157 ± 0.030) and the zeta potential was (32.1 ± 1.5) mV.The entrapment efficiency was (41.6 ± 1.7)%.Conclusion The gel possesses a good gelling and sustained release effect.The release mechanism of moxifloxacin hydrochloride from the gel was in accordance with the Korsmeyer-Peppas model.

In situ ophthalmic gel； Thermosensitive； Nanoparticle； Moxifloxacin hydrochloride； In vitro release

鐘守國

R944

A

1672-6170(2016)03-0034-04

2016-03-05；

2016-03-28)