大鼠腦出血后血腫周圍組織中樹突狀細胞的免疫功能研究

楊　斐　李小剛(通訊作者)

1)成都市龍泉驛區第一人民醫院　成都　610100　　2)瀘州醫學院附屬醫院神經內科　瀘州　646000

大鼠腦出血后血腫周圍組織中樹突狀細胞的免疫功能研究

楊斐1)李小剛2)(通訊作者)

1)成都市龍泉驛區第一人民醫院成都6101002)瀘州醫學院附屬醫院神經內科瀘州646000

【摘要】目的觀察實驗性大鼠腦血腫周圍組織樹突狀細胞(dendritic cells，DC)的分布情況，進一步分析腦出血后不同時相內，DC在局部中樞性神經組織中免疫功能的作用。方法制作實驗性大鼠基底節區腦血腫模型，分別檢測24 h、48 h、72 h、5 d和7 d各時相點神經功能障礙、腦組織水腫情況及局部腦組織中IL-6和GM-CSF的濃度、陽性DC數量。結果出血組GM-CSF濃度在48 h時增加，隨后仍保持持續性上升。實驗組IL-6濃度在術后48 h達到高峰，隨后下降；實驗組DC在術后24 h時觀察到，并隨時間的延長持續增加。結論實驗大鼠腦出血周圍組織中的微狀態變化，將限制和影響DC在不同時相的作用。在腦出血前期促進腦組織損害，腦出血后期有利于局部腦組織修復。

【關鍵詞】樹突狀細胞；腦血腫；免疫反應

研究表明，腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后，其血腫周邊組織中發生的免疫反應，密切影響病變區域神經組織病變。目前，研究發現，樹突狀細胞(dendritic cells，DC)存在于腦組織中，有極強的抗原呈遞現象[1]，并積極參與免疫反應。但在腦血腫周邊組織中的炎癥反應中，DC的作用尚無明確研究報道。本研究通過檢測大鼠腦血腫不同時相DC陽性數量的變化，研究DC在ICH后繼發性中樞神經系統(central nervous system，CNS)損傷中的作用。

1材料與方法

1.1材料SD大鼠50只。鼠立體定向儀；Image-Pro-Plus圖像分析系統；小鼠抗大鼠單克隆抗體OX62；IL-6、GM-CS檢測ELISA試劑盒；其他常用實驗器材等。

1.2方法實驗大鼠隨機分為腦出血組20只，假手術組20只。備用10只，用于模型失敗補充。根據實驗觀察時相再分為術后24 h、48 h、72 h、5 d、7 d 5個亞組。實驗組動物通過麻醉、固定、頭顱鉆孔。采集大鼠尾部凝固血液50 μL，在鼠立體定向儀引導下緩慢注入大鼠尾狀核。對照組不注血，余同上。根據Longa等[2]的分級標準，確定模型是否合格。

實驗動物術后相應時相點按Schaar等[3]的神經功能障礙評定方法評分后再行處死，立即取出全部腦組織，選取注射點前部腦組織檢測含水量。后部組織近血腫處用于固定蠟塊制作。腦組織含水量檢測：使用干/濕法測定不同時相標本含水量。免疫組化染色法(S-P法)：具體操作步驟按照產品說明進行。簡化操作步驟：固定蠟塊標本切片、制片(片厚4 μm)，脫蠟后切片PBS液洗3次，行抗原修復，滴加過氧化酶阻斷劑10 min。而后依次PBS液洗5 min，兔血清封閉，加入mAbOX62(一抗、37 ℃、2 h)、二抗(37 ℃、2 h)及加親和素標記的HRP，PBS液洗5 min。3-氨基-9-乙基卡巴唑顯色5 min。蘇木素復染，脫水，透明，封片，陽性DC細胞染呈紅色，其他細胞染色為藍色。CD83抗原修復操作：于0.1%胰蛋白酶CaCl2中 37 ℃消化20 min。細胞計數參照Molin法，用Image-Pro-Plus圖像分析系統計數每10 mm2單位面積的腦組織中含有陽性染色細胞數。

1.3統計學處理采用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，2組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1神經功能障礙評分各觀察時間點實驗動物神經功能障礙評分見表1。

表1　2組術后神經功能障礙評分比較±s)

注：與對照組比較，▲P<0.05

2.2腦組織含水量測定見表2。

表2術后2組大鼠不同時相標本中含水含量變化

組別24h48h72h5d7d假手術組77.67±0.3678.32±0.0177.96±0.2677.84±0.4877.92±0.35ICH組78.15±0.9179.49±0.25▲78.47±0.27▲78.31±0.6478.12±0.45t值0.789.182.700.790.66P值0.460.000.350.790.53

注：與對照組比較，▲P<0.05

2.3腦組織IL-6含量檢測見表3。

表32組大鼠術后不同時相腦組織IL-6濃度變化

組別24h48h72h5d7d假手術組1.118±0.1651.153±0.2061.123±0.1871.164±0.1941.220±0.154ICH組5.884±0.365▲7.179±0.756▲6.312±0.175▲3.660±0.26▲1.876±0.245t值4.064.884.424.070.95P值0.020.000.010.030.39

注：與對照組比較，▲P<0.05

2.4腦組織GM-CSF含量檢測見表4。

表42組大鼠術后血腫周圍腦組織中GM-CSF含量變化

組別24h48h72h5d7d假手術組1.549±0.4211.670±0.2471.587±0.2631.564±0.4211.536±0.743ICH組1.661±0.3022.638±0.624▲3.642±0.542▲4.409±0.324▲4.763±0.208▲t值0.803.593.795.066.17P值0.040.010.000.000.00

注：與對照組比較，▲P<0.05

2.5血腫周圍DC細胞免疫組化染色后實驗組和對照組在每10 mm2的切片中觀察到OX62+陽性細胞(紅色著染，見圖1～4)。單位面積中含有的OX62+細胞數量變化見表5。24 h時ICH組OX62+細胞數量開始增加，隨后ICH組繼續增加，各觀察時間點與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

(×400倍)

圖148 h OX62+cell

(×400倍)

圖272 h OX62+cell

(×400倍)

圖35 d OX62+cell

(×400倍)

圖47 d OX62+cell

表5　2組大鼠不同時相腦組織中OX62+數量變化

注：與對照組比較，▲P<0.05

3討論

DC廣泛分布于機體的組織和器官，成熟DC發揮抗原呈遞作用[1，4]。正常情況下DC在腦組織中不易觀察到，原因可能是血腦屏障阻止了周圍DC向腦組織穿越，CNS中不具備DC分化成熟的環境。但在特定情況下，可發現腦組織存在成熟DC。Zozulya等[4]報道大鼠腦膜基質中存在少量樹突狀細胞。在多發性硬化患者腦組織研究中發現，病理組織標本周圍的腦實質血管套中存在少量DC。Takato等[6]研究發現，實驗性大鼠腦血腫周圍的組織中有DC存在。進一步研究發現,CNS中DC細胞的可能來源：單核細胞；腦膜、脈絡叢等處的DC遷移，以及中樞神經系統中的 T細胞、NK細胞、單核細胞轉化；病灶周圍的神經膠質細胞轉化[7]。目前研究指出，部分炎性因子，如IL-1、IL-6、IL-12、TNF、GM-CSF等表達水平與DC有關[8]。Fischer等[9]通過體外試驗發現，GM-CSF以及腦組織共同培育能夠得到分化成熟的DC細胞，且DC細胞能夠表達MHC-Ⅱ、CD54、CD83、CD80等膜表面分子，起到抗原呈遞及免疫調節功能[10-11]。在大鼠CNS中實質內均有GM-CSF表達，主要來源于膠質細胞。

本研究顯示，周圍組織中GM-CSF、OX62+細胞水平變化均顯著上升，表明在血腫崩解產物及炎性細胞因子的作用下病灶周圍膠質細胞分泌、釋放GM-CSF，同時可能由于炎性因子改變了血腦屏障的通透性導致血液中的DC進入腦組織，以及大腦其他部位的DC在炎性趨化因子作用下遷移到病灶周圍，從而導致這些成熟型DC進一步發揮免疫調節功能。

3.1在腦出血前期的作用及機制DC是呈遞抗原能力極強的細胞，同時也在調節機體的免疫反應中發揮多種作用[3，10]。機體處于病原體感染或組織壞死時，細菌核酸、組織細胞崩解產物等可誘導并趨使未成熟DC向病變部位移動，同時逐漸分化為成熟DC，成熟DC激活初始T細胞，使之發育為輔助性T細胞(helper T cells，Th)和效應T細胞(effector T cells，Te)，并發揮免疫應答作用。同時成熟DC不斷分泌IL-2、IFN-γ進一步促免疫反應[12-13]。

本實驗觀察到48 h內ICH組大鼠腦組織中IL-6和DC均升高。表明DC血腫形成48 h內可能發揮促進炎癥功能。推測其機制：該時相內血腫崩解產物和隨之產生的壞死組織中出現了大量的抗原，在這些抗原和局部產生的免疫細胞因子刺激下，活化了DC，并發揮呈遞抗原、激活T細胞，誘導并促進炎癥反應。

3.2在腦出血中后期的作用及機制本實驗中DC腦出血后48 h～7 d仍呈逐漸升高趨勢與IL-6變化相反，這一情況和其他CNS中的炎癥，如MS不一致[14]。外周DC在免疫應答中的作用取決于其所處的環境狀況。無感染時未成熟的DC細胞接觸到自身抗原后，誘導抑制性T細胞分化，從而誘導免疫耐受[15-16]。當病原體感染或組織出現壞死時，DC能夠通過促進IFN-γ、IL-2、IL-6表達水平的升高而誘導免疫反應[17]。通過促進IL-5、NO的表達而抑制Th細胞分化及增殖，并促進活化的T細胞凋亡，誘導CD8+Ts活化，發揮免疫抑制效果[18]。

本研究發現，DC細胞的增殖水平在48 h～7 d內達到高峰，可能是由于炎癥反應在形成血腫48 h后達到高峰水平，此時抗原水平逐漸下降。但局部病灶組織仍存在高濃度的炎癥促進因子，如IL-1、TNF-α、IL-6等，從而導致DC繼續分化并成熟。但此時DC細胞周圍的微環境已出現變化，抗原水平不斷下降、正常組織表達增多，所以，DC不再強化免疫反應，而通過增加IL-4、IL-10、IL-5、NO的表達，起到免疫抑制效果。

綜上，實驗大鼠腦出血周圍組織中的微狀態變化，將限制和影響DC在不同時相的作用。在腦出血前期促進腦組織損害，腦出血后期有利于局部腦組織修復。

4參考文獻

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(收稿 2015-07-16)

Study of immune function of dendritic cells in perihematoma tissue of rats after intracerebral hemorrhage

YangFei*,LiXiaogang

*TheFirstPeople’sHospitalofLongquanyiDistrictinChengduCity,Chengdu610100,China

【Abstract】Objective To observe the distribution of dendritic cells (DC) in perihematoma tissue through the establishment of intracerebral hemorrhage (ICH) model of rat, and to analyze the immune function of dendrite cells in the local central nervous tissue, in the different phases after ICH. Methods The model of ICH in the caudate nucleus of rat was produced; and the neurological dysfunction, cerebral edema, concentration of interleukin-6 (IL-6) and granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) in local brain tissue, count of DC-positive were detected at 24-hour, 48-hour, 72-hour, 5-day and 7-day time points. Results The concentration of GM-CSF in ICH group began to ascend at 48-hour, and then remained persistent rose. The concentration of IL-6 in the experimental group was reached the peak at 48-hour after surgery, and then decreased; DC was observed in the experimental group at 24-hour after operation, and continued to increasing with the time prolonged. Conclusion The changes of micro environmental conditions in perihematoma tissue of ICH model of rat will restrict and influence the effect of DC according different phases. It may aggravate the brain damage in the early stage of ICH, and promote the damage tissue repaired in late stage.

【Key words】Dendritic cell; Intracerebral hemorrhage; Immune response

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)11-0029-03