彌可保對糖尿病神經病理性疼痛大鼠背根神經節Nav1.7表達的影響

張春玲　任幼紅(通訊作者)

1)山東平度市人民醫院內分泌科　平度　266700　2)鄭州大學第一附屬醫院康復科　鄭州　450052

彌可保對糖尿病神經病理性疼痛大鼠背根神經節Nav1.7表達的影響

張春玲1)任幼紅2)(通訊作者)

1)山東平度市人民醫院內分泌科平度2667002)鄭州大學第一附屬醫院康復科鄭州450052

【摘要】目的探討彌可保對鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型大鼠痛閾及背根神經節(DRG)中電壓門控性鈉離子通道亞型1.7(Nav1.7)表達的影響。方法健康雄性SD大鼠75只，體質量200～250 g，隨機分為空白對照組(C組)、模型組(DNP組)和彌可保組(DNP+M組)，每組25只，其中模型組和彌可保組皮下注射STZ 75 mg/kg制作糖尿病大鼠模型，剔除血糖低于16.7 mmol/L的大鼠，14 d后給予安慰劑和彌可保(600 μg/kg)腹腔注射，1次/d，觀察STZ注射前1 d及注射后3、7、14、21、28 d機械縮足反射閾值(mechanical withdrwal threshold，MWT)，行為學測試完成后，采集大鼠背根神經節(DRG)標本，用免疫組化和Western blot方法分別檢測其鈉離子通道Nav1.7蛋白表達水平。結果與對照組比較，模型組大鼠MWT降低，DRG中Nav1.7 的表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，彌可保組大鼠MWT升高，DRG中Nav1.7 的表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)。結論彌可保通過抑制糖尿病大鼠DRG中 Nav1.7 表達，從而緩解大鼠神經病理性疼痛。

【關鍵詞】彌可保；糖尿病神經病理性疼痛；背根神經節；Nav1.7

研究表明，糖尿病患者高血糖誘發微循環障礙，最終可導致痛性糖尿病神經病變的發生，其中以糖尿病神經病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)最為常見[1]。患者可出現自發痛、痛覺過敏、觸誘發痛及感覺異常，嚴重影響生活質量[2]，其中疼痛過敏由神經元興奮性升高引起，而神經元興奮性與電壓門控鈉離子通道息息相關。研究指出,背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)中高表達的Nav1.7與人類遺傳性疼痛疾病密切相關[3]，編碼Nav1.7的SCN9A基因錯義突變導致原發性紅斑肢痛癥[4]和陣發性劇痛癥[5]，而SCN9A基因堿基缺失則引起先天性無痛癥[6]。彌可保(甲鈷胺)早期應用能改善糖尿病患者的神經癥狀和感覺傳導速度[7]。本實驗旨在觀察彌可保對糖尿病神經病理性疼痛大鼠痛閾及DRG中Nav1.7蛋白表達的影響，為治療糖尿病神經病理性疼痛提供理論基礎。

1對象與方法

1.1實驗對象健康雄性SD大鼠75只，體質量200～250 g，由河南省實驗動物中心提供，采用隨機數字表法將其分為3組：對照組(C 組)、模型組(DNP組)和彌可保組(DNP+M組)，每組25只。

1.2試劑與設備彌可保注射液(衛材中國藥業有限公司)，鏈脲佐菌素(streptozocin，美國Sigma公司)，Nav1.7 兔單克隆一抗(abcam公司，美國)，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔抗體(南通碧云天公司)，血糖儀(中國歐姆龍公司)，von Frey Hairs(美國Stoelting公司)。

1.3DNP模型制備參照文獻[8]制備DNP模型，測大鼠基礎痛閾后皮下注射STZ 75 mg/kg，給藥后7 d測量尾靜脈血糖穩定>16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功，給藥后14 d痛閾降低幅度>基礎痛閾的15%為DNP模型制備成功。14 d后分別給予安慰劑和彌可保600 μg/(kg·d)腹腔注射，1次/d，連續28 d，測量STZ注射前1 d、STZ注射后3、7、14、21、28 d時間點MWT。

1.4機械縮足反射閾值(mechanical withdrwal threshold，MWT)的檢測參照文獻[9]，采用“up and down”方法測定50%縮足閾值。將大鼠置于金屬篩網上的有機玻璃箱中適應30 min后，用特制的von Frey纖維絲(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15 g)垂直刺激大鼠后肢足底掌部皮膚，持續時間≤4 s，若大鼠出現縮足或舔足，即記為陽性反應。測定首先從中等強度(2.0 g)開始，不能引起陽性反應時，則增大1級力度刺激；如出現陽性反應，則減小1級力度刺激，檢測出現第1次陽性或陰性反應時記錄表上后移記錄，再測定4次。為避免前一刺激的影響，一般2次檢測之間相隔30 s。陽性反應用“×”表示，陰性反應用“○”表示，計算出大鼠50%機械縮足閾值。

1.5組織學觀察大鼠用10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，經左心室灌注冰冷生理鹽水300 mL，接著使用4%多聚甲醛400 mL灌注。取L3-5DRG置于4%多聚甲醛(pH 7.2)固定2 h，后放入30%蔗糖溶液，待其在蔗糖溶液沉底后冰凍切片，晾片過夜，0.01 mol/L的PBS漂洗3次。5% 胎牛血清封閉 2 h 后，入一抗Anti-Nav1.7(1∶200) 孵育。一抗 4 ℃孵育 24 h。PBS漂洗3 次，入二抗Alexa Fluor 488(donkey anti-rabbit IgG，1∶200)，室溫孵育2 h。PBS漂洗3次后封片劑封片。德國Leica顯微鏡照相，圖像采用Biosens Digitl Imaging System v1.6軟件分析處理。

1.6Western blot冰上操作取L3-5DRG，放入-80 ℃冰箱保存備用。提取蛋白，在SDS-PAGE凝膠系統中上樣電泳，半干轉法將目的蛋白轉移至NC膜上，5%脫脂奶粉/TBST 20 mL，水平搖床室溫封閉1 h，分別 Anti-Nav1.7 一抗(1∶200)，Anti-β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，堿性磷酸酶標記兔二抗(1∶1 000)，室溫搖床孵育2 h，發光曝光后所得條帶光密度分析，統計分析數據。

1.7統計學分析采用 SPSS 17.0軟件進行統計學分析，實驗結果均以均數±標準誤表示，行為學分析結果采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，Western blot和免疫熒光結果使用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1行為學結果為探討彌可保對DNP大鼠糖尿病神經病理痛的影響，我們給模型組和彌可保組皮下注射STZ 75 mg/kg制作糖尿病大鼠模型，14 d后分別給予安慰劑和彌可保(600 μg/kg)腹腔注射，1次/d，連續28 d，測定STZ注射前1 d及注射后3、7、14、21、28 d MWT。結果顯示，與對照組比較，DNP組和M組隨著時程的延長，MWT逐漸降低，至14、21、28 d差異有統計學意義(P<0.05)。與DNP組比較，M組MWT 14、28 d升高差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1彌可保對DNP大鼠各時點MWT的影響與對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與DNP組比較，#P<0.05

2.2形態學與Western blot結果為進一步探討彌可保減輕DNP大鼠糖尿病神經病理疼痛的機制，我們檢測了河豚毒素敏感性離子通道Nav1.7在大鼠DRG中的表達。我們選擇了大鼠STZ注射后28 d時間點，免疫熒光顯示，DNP模型大鼠的DRG神經元中的Nav1.7蛋白明顯增加(P<0.05)，同樣Western blot結果顯示，與C組相比較，DNP大鼠DRG中，Nav 1.7表達顯著增加(P<0.05)。與DNP組比較，形態學和Western blot結果均顯示，M組Nav 1.7表達明顯減少(P<0.05)。見圖2、3。

圖23組大鼠DRG神經元Nav1.7表達的形態學結果與DNP組相比，*P<0.05，**P<0.01；scale bar=50 μm(n=9)

圖33組大鼠DRG神經元Nav1.7表達的Western blot結果與DNP組相比，*P<0.05，**P<0.01

3討論

彌可保主要成分為甲鈷胺，維生素Bl2的一種衍生物，即在中心的鈷分子上結合了1個甲基，其活性遠勝于普通的維生素B12，能促進神經軸突的再生，修復損傷的神經，可改善糖尿病周圍神經病變的癥狀，增加神經傳導速度[7]。本研究選擇彌可保進行實驗，結果表明，給予彌可保治療DNP大鼠痛閾明顯升高，表明彌可保可減輕大鼠DNP。

Nav1.7是河豚毒素敏感性(TTX-S)鈉離子通道，在疼痛中起著至關重要的作用。在大鼠糖尿病病理性疼痛模型中，Nav1.7的表達和電流均呈上升趨勢[8-10]，且在坐骨神經結扎的神經病理性疼痛模型中，DRG中Nav1.7的表達也呈上升趨勢[11]。因此，在糖尿病神經病理性疼痛大鼠DRG神經元中Nav 1.7表達增加，可能是DRG神經元興奮性大幅度提高的原因。本研究結果表明，與DNP組比較，彌可保組痛閾升高Nav1.7表達增加下調，說明腹腔注射彌可保可減輕糖尿病神經病理性疼痛，其機制可能與抑制DRG神經元Nav1.7的表達有關。

綜上所述，彌可保腹腔注射可緩解大鼠糖尿病神經病理性疼痛，并顯著下調糖尿病周圍神經病變模型大鼠DRG中NaV1.7蛋白。由此我們推測，彌可保對糖尿病周圍神經病變模型大鼠的治療機制可能與其能夠下調DRG中Nav1.7蛋白有關，彌可保有可能具有阻斷NaV1.7通道激活途徑中的某些環節或直接抑制Nav1.7通道活性的作用，但其明確的治療機制尚不清楚，仍需進一步研究。

4參考文獻

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(收稿 2015-06-07)

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)11-0036-03