米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI）在畢赤酵母中的表達研究及其酶學特性分析

何永梅，王 波，李大偉，田永生，彭日荷*，姚泉洪*

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106）

?

米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI）在畢赤酵母中的表達研究及其酶學特性分析

何永梅1，王 波2*，李大偉1，田永生2，彭日荷2**，姚泉洪2**

（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海市農業科學院生物技術研究所，上海201106）

摘 要：采用PTDS方法人工合成米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI），通過電擊將其轉化到畢赤酵母中表達，并采用DNS法對重組酶的酶學性質進行分析。結果表明：該酶耐酸但不耐熱，最適反應溫度為50℃，最適pH 為3.0，在30—45℃和pH 4—8時內切葡聚糖酶可保持90%以上酶活力，在底物CMC存在時其熱穩定性有一定的提高。10 mmol/L的金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和Fe3+對酶有激活作用，Mn2+對酶則起抑制作用。該酶對胰蛋白酶有一定的抗性，對胃蛋白酶抗性相對較差。

關鍵詞：米曲霉；內切葡聚糖酶；畢赤酵母；酶學性質

*共同第一作者

**通信作者，Tel：021-62203180，E-mail：pengrihe69@yahoo.com；E-mail：yao.quanhong65@yahoo.com

隨著微生物食品生物工程技術的蓬勃發展，米曲霉（Aspergillus oryzae）作為發酵工業和食品加工業的重要菌種，日益受到廣泛關注。米曲霉是一種好氣性真菌，常見于糧食、發酵食品、腐敗有機物、土壤等處［1］。米曲霉在調味品行業主要用于釀造醬油、豆豉、米酒等發酵食品，在酶制劑行業實現了工業化生產，部分用作食品添加劑；也用于生產天冬氨酸蛋白酶、嗜熱堿性脂肪酶等異源蛋白及人溶菌酶和乳鐵蛋白等醫藥蛋白［2］。此外，米曲霉及其提取物（如艾美福Amaferm）對牲畜、家禽的消化功能、生產性能有很大影響［3］。

2005年，米曲霉RIB40（ATCC42149）基因組測序工作由日本幾家科研機構和企業聯合完成，該菌株是研究米曲霉生理調控的模式菌株，測序結果表明米曲霉基因組有8條染色體［2］。常淑君等［4］于2014年成功構建了米曲霉RIB40的全長cDNA表達文庫，為米曲霉功能基因的開發以及次生代謝產物合成途徑相關基因的篩選與克隆奠定了基礎。

米曲霉是一類產生復合酶的菌株，能分泌纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、植酸酶等多種酶類［5］。纖維素酶是一個多組分酶系，包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶［6-7］。其中，內切β-葡聚糖酶能特異作用于β-1，4-糖苷鍵，水解纖維素分子內部的非晶體區或羧甲基纖維素中的長鏈纖維分子，進而產生大量小分子纖維素，所以內切葡聚糖酶是重要的工業用酶，不僅是提高醬油膳食纖維含量的一個關鍵酶［8］，也可以作為飼料添加劑，除去飼料中的抗營養因子葡聚糖，提高飼料的轉化率和動物的生長性能［9-10］。

常見的產β-葡聚糖酶的霉菌有康氏木霉、里氏木霉、瑞氏木霉和黑曲霉等［11］。β-葡聚糖酶在食品和飼料工業等方面有著廣闊的應用前景，正逐漸成為當前研究的熱點。近年來，國內有許多關于纖維素酶基因克隆與表達的報道，但對米曲霉產內切葡聚糖酶的研究較少。為此，本試驗對來源于米曲霉的β-1，4-內切葡聚糖酶的酶學性質進行研究，以期為進一步探索酸性纖維素在食品工業中的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株由本實驗室保存；畢赤酵母Pichia Pastoris GS115和pPIC9K分泌型表達載體購自Invitrogen公司。

1.1.2酶和試劑

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等工具酶購自上海生工；限制性內切酶、蛋白Marker購自TaKaRa公司；CMC-Na購自Sigma公司。

1.1.3培養基

LB、YPD、BMGY和BMMY培養基。

1.2方法

1.2.1AoEGLAI基因的合成和載體構建

按照畢赤酵母密碼子偏愛，采用PTDS（PCR-based two-step DNA synthesis）方法進行米曲霉葡聚糖酶基因AoEGLAI的化學合成及優化［12］，其信號肽及引物位置如圖1所示。PCR擴增結束后將PCR產物凝膠回收并連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α進行序列測定。測序正確的AoEGLAI經Bam HI和Sac I酶切后，連接到含有AOX啟動子的畢赤酵母表達載體pPIC9K，得到重組質粒pYR1721進行畢氏酵母轉化。

圖1　AoEGLAI序列中信號肽及引物Fig.1 Signal peptide and primers in sequence of AoEGLAI

1.2.2畢赤酵母重組表達載體的電擊轉化

畢赤酵母菌株GS115于50 mL YPD培養基中30℃培養至OD600為1.1—1.3，離心收集菌體。用預冷的無菌水洗菌體，4℃、8 000 r/min離心去上清液，用20 mL預冷的山梨醇懸浮菌體，再離心收集菌體并用0.5 mL預冷的山梨醇懸浮。取80 μL菌液，加入2 μL經Sal I線性化的重組質粒pYR1721，冰浴5 min后電擊，結束后立即加入0.8 mL預冷的0.6 mol/L山梨醇，混合后取200 μL菌液涂布于山梨醇平板上，30℃培養2—4 d直至轉化子出現。

1.2.3重組畢赤酵母工程菌株的誘導表達

將陽性轉化子接種于含25 mL BMGY培養基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min搖床培養48 h。離心收集菌體，用無菌水洗3次，將菌體轉移至25 mL BMMY誘導培養基中，30℃、220 r/min繼續培養，每24 h補加250 μL 100%甲醇至終濃度為1%。將培養基于4℃、8 000 r/min離心5 min，收集上清，即為粗酶液。

1.2.4重組AoEGLAI的純化及分析

取2 mL誘導后的粗酶液，首先通過由緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）平衡好的Ni柱，再經洗滌液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）洗滌，及洗脫液C（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫，最后由緩沖液D（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mmol/L EDTA，10%甘油）進行透析。純化后的重組AoEGLAI采用12%的SDS-PAGE進行分析，并通過考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.3酶活力測定

采用DNS定糖法測定內切葡聚糖酶的活性［13］。具體操作如下：取0.07 mL粗酶液，加入0.07 mL 0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.0）及0.14 mL 1%溶于此緩沖液的CMC-Na，37℃反應1 h后，加入0.28 mL DNS試劑，煮沸10 min，在540 nm波長下測定光吸收值。每分鐘產生1 μg葡萄糖所需要的酶量為1個酶活單位。

1.3.1重組AoEGLAI最適pH、pH穩定性、最適溫度及溫度穩定性測定

測定方法參考包文華等［14］。在pH 2、3、4、5、6、7、8及20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的條件下測定重組葡聚糖酶AoEGLAI的活力，得到最適pH及最適溫度。在此pH及溫度條件下處理后測定剩余酶活力，得到重組酶的pH穩定性和溫度穩定性。

1.3.2重組AoEGLAI在有底物保護條件下的熱穩定性

酶與水溶的CMC-Na溶液混合后，以酶與同體積的水混合液為對照，于70℃處理10—60 min，間隔10 min取樣，置于4℃，待所有樣品處理完并降于相同溫度后，對照加入1.5%的CMC-Na溶液，其余加入1%的CMC-Na溶液。37℃反應1 h后測活的樣品與70℃處理后直接顯色的樣品對比。

1.3.3不同金屬離子對AoEGLAI活性的影響

酶分別與終濃度為1mmol/L、10mmol/L的金屬離子溶液CuSO4、CaCl2、Ca（NO3）2、Fe（NO3）2、MnSO4、ZnSO4、MnCl2、K2SO4、MgSO4、FeCl3、LiCl、CrCl3，及溶于pH 5.0緩沖液中的底物CMC-Na溶液混合后，37℃反應1 h，測定酶在上述反應體系中的活力。對照組為水，以其活力值為100%。

1.3.4蛋白酶對AoEGLAI活性的影響

酶分別與含量為5×10-4g的胃蛋白酶、胰蛋白酶及溶于pH 5.0緩沖液中的底物CMC-Na溶液混合后，37℃反應1 h，測定其活力。

圖2　AoEGLAI蛋白的SDS-PAGE檢測結果Fig.2 SDS-PAGE detection result of AoEGLAI

2　結果與分析

2.1SDS-PAGE分析

粗酶液濃縮純化后，進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示。純化后的蛋白條帶單一，蛋白大小約為27 kD，與生物信息學預測一致，表明米曲霉內切葡聚糖酶在畢赤酵母中成功表達。

2.2最適pH和pH穩定性

如圖3所示：重組AoEGLAI最適pH為3，在pH 2—4有80%的活力，pH 8時其活力剩余20%。如圖4所示：處理1 h及4 h時，重組AoEGLAI分別在pH 3—8及pH 4—8仍有很高的活性（90%）。

圖3　AoEGLAI的最適pHFig.3 The optimal pH of AoEGLAI

圖4　AoEGLAI的pH穩定性Fig.4 pH stability of AoEGLAI

2.3最適溫度和溫度穩定性

如圖5所示：重組AoEGLAI最適溫度為50℃，在30—70℃有60%以上的活力。如圖6所示：重組AoEGLAI在40℃處理10 min后其活性為80%，50℃處理10 min后其活性為40%，1 h后僅剩7%，活性下降較快，而70℃處理10 min后其活性基本喪失。

圖5　AoEGLAI的最適溫度Fig.5 The optimal temperature of AoEGLAI

圖6　AoEGLAI的溫度穩定性Fig.6 The temperature stability of AoEGLAI

2.4酶在有底物保護條件下的熱穩定性

70℃處理后，經37℃反應1h并測活的樣品與處理后直接顯色的樣品相比，熱穩定性明顯提高。如圖7所示：重組AoEGLAI在70℃處理10 min后幾乎無活性，而與底物CMC-Na混合后在相同的溫度條件下處理，10 min后仍有30%以上的酶活力。

2.5不同金屬離子對AoEGLAI活性的影響

如圖8所示：用1 mmol/L的金屬離子處理，除Mn2+對酶起抑制作用外，其他離子無明顯作用；而在10 mmol/L下，金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、K+、Gr3+、Fe2+和Fe3+對酶有激活作用，Mn2+的抑制作用不如1 mmol/L時明顯；Mg2+及Li+在兩個濃度下對重組AoEGLAI均無明顯影響。

2.6蛋白酶對AoEGLAI活性的影響

如圖9所示：重組AoEGLAI在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下有一定程度的水解，其活性隨著處理時間的延長逐漸下降。其中胃蛋白酶的水解作用較明顯，酶活下降較快，而重組AoEGLAI對胰蛋白酶則有一定的抗性，作用6 h仍有70%的活性，處理24 h后仍有酶活。

2.7酶反應動力學參數

利用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，以反應速度的倒數（1/V）對底物質量濃度的倒數（1/S）作圖，得到一條直線，如圖10所示：該重組酶AoEGLAI的米氏常數Km =22.47 g/L，最大反應速度Vmax =1.22 g/（min·L），純化后重組AoEGLAI的比酶活為2.7×105IU/mg。

圖7　AoEGLAI在底物保護條件下的熱穩定性Fig.7 Thermal stability of AoEGLAI under substrate protection

圖8　 不同金屬離子對AoEGLAI的影響Fig.8 Effect of different metal ions on AoEGLAI

圖9　胰蛋白酶和胃蛋白酶對AoEGLAI的影響Fig.9 Effect of trypsin and pepsin on AoEGLAI

圖10　酶的反應動力學參數Fig.10 Kinetic parameters of AoEGLAI

3　結論與討論

自然界中存在眾多能產生纖維素酶的生物，包括某些低等動植物、真菌、細菌和放線菌。纖維素酶的常見表達宿主菌包括大腸桿菌、畢赤酵母、真菌（如米曲霉）等，其中，甲基營養型酵母表達系統中的巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為現代分子生物學研究中一種重要的工具模型，以其自身分泌的背景蛋白少，糖基化程度低，對營養要求低，可采用廉價的培養基，以及易于高密度發酵的優點［15］，已成為異源表達最常用的一種表達系統。來源于芽胞桿菌、苜蓿根瘤菌、里氏木霉、草莓等的β-1，4-外切葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達已有報道［9］，本試驗則對來源于米曲霉的內切葡聚糖酶的表達進行了研究。

不同來源的內切β-1，4-葡聚糖酶其性質相差甚遠，真菌一般產酸性纖維素酶，本試驗中所表達的來自于米曲霉RIB40的重組AoEGLAI最適pH為3.0，與大多數真菌所產纖維素酶為酸性的特征相符，且霉菌來源的AoEGLAI其pH穩定性范圍較寬，與鄒東恢等［11］報道一致。大多數內切葡聚糖酶最適溫度為50—55℃，重組AoEGLAI最適溫度為50℃，與Viikari等［16］報道的Trichoderma reesei類似，該酶的最適作用溫度是50℃，在40℃條件下保存60%的剩余活力，且在有底物保護條件下穩定性還會有一定程度的提高。動物的體溫在40℃左右，重組AoEGLAI若作為飼料添加劑，在通過動物的胃腸道時可在接近最適催化溫度下發揮作用，對其酶活影響不大［17］。

韓學易等［18］對來源于米曲霉的giF-10重組內切葡聚糖酶的酶學性質進行了分析，與本試驗重組AoEGLAI相比，其最適pH為4.0，雖同為酸性纖維素酶，但重組AoEGLAI對酸性環境的耐受力更強。重組giF-10的最適反應溫度是45℃，略低于重組AoEGLAI的最適溫度，且重組AoEGLAI的pH穩定性和溫度穩定性均優于重組giF-10。黃君等［9］將黑曲霉L3內切葡聚糖酶在畢赤酵母中高效表達后獲得重組酶EGI，其最適pH為5.0，不及重組AoEGLAI耐酸，但其最適反應溫度為70℃，對高溫的耐受能力明顯強于重組AoEGLAI，故更適合作為啤酒工業的復合酶。喬宇等［19］研究了里氏木霉內切-β-葡聚糖酶II在畢赤酵母中的表達，其最適反應溫度與重組AoEGLAI較為接近，最適pH則與黑曲霉L3重組EGI相同，均高于重組AoEGLAI。

金屬離子對內切β-1，4-葡聚糖酶具有不同程度的影響，Mn2+對該酶起抑制作用，而10 mmol/L的金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和Fe3+則對酶有激活作用，這與彭維等［20］的研究結果不同，其報道中指出Mn2+激活效果顯著而Cu2+起抑制作用，導致這種差異的原因可能是由于底物不同或者酶來源不同而產生的。

胃蛋白酶和胰蛋白酶均能降低重組AoEGLAI的活性，但重組AoEGLAI對兩種蛋白酶有一定的耐受力，特別是胰蛋白酶，處理24 h后仍有活力。李衛芬等［21］在里氏木霉β-葡聚糖酶穩定性研究中提到，胃蛋白酶和胰蛋白酶對β-葡聚糖葡聚糖酶活幾乎無影響；而孫建義等［22］在體外模擬動物胃腸條件下研究結果表明，胃蛋白酶對β-葡聚糖酶活無明顯影響，而胰蛋白酶卻有一定的促進作用。

參 考 文 獻

［1］劉麗萍，劉麗華.米曲霉研究進展與應用［J］.中國調味品，2008（4）：28-32.

［2］李方方，潘力.米曲霉基因表達研究進展及應用［J］.中國釀造，2008，27（12）：1-3.

［3］孫安權，沙海鋒.米曲霉提取物對瘤胃生態及奶牛生產性能的影響［J］.乳業科學與技術，2006，119（4）：184-186.

［4］常淑君，祖永平，陶波，等.米曲霉（Aspergillus oryzae）RIB40全長cDNA文庫的構建［J］.微生物學通報，2014，41（8）：1485-1490.

［5］趙龍飛，徐亞軍.米曲霉的應用研究進展［J］.中國釀造，2006，25（3）：8-10.

［6］BHIKHABAI R，JOHANSSON G，PETTERSON G.Isolation of celluloytic enzymes from Trichoderma reesei QM9414［J］.Appl Biochem，1984，6（5/6）：336-345.

［7］SCHULEIN M.Protein engineering of cellulases［J］.BBA-Protein Struct Mol Enzymol，2000，1543（2）：239-252.

［8］周雄川，李冬生，陳雄，等.米曲霉Y6產中性蛋白酶和內切葡聚糖酶的研究［J］.中國釀造，2013，32（10）：35-39.

［9］黃君，張昌毅，趙述淼，等.黑曲霉內切β-1-4-葡聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達［J］.華中農業大學學報，2008，27（5）：611-615.

［10］OFFICER D I.Efect of multi-enzyme supplements on the growth performance of piglets during the pre-and postwean-ing periods［J］.Animal Feed Sci Technol，1995，55：55-65.

［11］鄒東恢，江潔.β-葡聚糖酶的開發與應用研究［J］.農產品加工，2005（8）：7-9.

［12］XIONG A S，YAO Q H，PENG R H，et al.PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences［J］.Nature Protocol，2006，1（2）：791-797.

［13］陳紅歌，朱靜，梁改琴，等.黑曲霉木聚糖酶的純化與性質［J］.菌物學報，2000，19（1）：111-116.

［14］BAO W H，PENG R H，ZHANG Z，et al.Expression，characterization and 2，4，6-trichlorop henol degradation of laccase from Monilinia fructigena［J］.Mol Biol Rep，2012，39（4）：3871-3877.

［15］婁瑞娟，羅利龍，張霞，等.巴斯德畢赤酵母表達系統的研究進展和前景展望［J］.生物學雜志，2010，27（5）：73-76.

［16］VIIKARI L，ALAPURANEN M，PURANEN T，et al.Thermostable enzyme in lignocelluloses hydrolysis［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2007 （108）：121-145.

［17］魏曉飛，王在貴，陳鍵.β-葡聚糖酶的酶學性質研究［J］.中國飼料，2007（9）：17-19.

［18］韓學易，王春梅，陳惠.米曲霉giF-10內切葡聚糖酶基因的克隆表達及酶學性質分析［R］.食品與發酵工業，2012，38（10）：17-22.

［19］喬宇，毛愛軍，何永志，等.里氏木霉內切-β-葡聚糖酶II基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究［J］.菌物學報，2004，23（3）：388-396.

［20］彭維，歐愛芬.金屬離子對酶活性影響研究［J］.釀酒，2013，40（1）：60-62.

［21］李衛芬，孫建義，顧賽紅.里氏木霉β-葡聚糖酶穩定性研究［J］.西南農業大學學報，2001，23（2）：97-99.

［22］孫建義，李衛芬，顧賽紅.體外模擬動物胃腸條件下β-葡聚糖酶穩定性的研究［J］，中國畜牧雜志，2002，38（1）：18-19.

（責任編輯：閆其濤）

Expression and characterization of recombinant endo-β-1，4-glucanase from Aspergillus oryzae in Pichia pastoris

HE Yong-mei1，WANG Bo2*，LI Da-wei1，TIAN Yong-sheng2，PENG Ri-he2**，YAO Quan-hong2*
（1College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：The AoEGLAI gene was chemically synthesized by PTDS（PCR-based-two-steps DNA synthesis）strategy in this study.Then，the AoEGLAI gene was transformed into Pichia pastoris by electroporation and the enzymatic properties of recombinase were analyzed by DNS method.The results showed that the enzyme is acid proof but not heat resistant，the optimum temperature is 50℃，and the optimum pH is 3.The enzyme activity could be maintained 90%at 30—45℃and pH 4—8.In the presence of substrate CMC，the enzyme’s thermal stability improved.In addition，Cu2+，Ca2+，Zn2+，Gr3+，Fe2+and Fe3+of 10 mmol/L had active effects on the enzyme whereas Mn2+had inhibitory effect on it.This enzyme had certain resistance to trypsin，and relatively poor resistance to pepsin.

Key words：Aspergillus oryzae；Endo-β-1，4-glucanase；Pichia pastoris；Enzymatic property

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-018-06

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.04

收稿日期：2015-02-02

基金項目：上海市農業委員會重點項目（No.2011-1-8，2013D-8）

作者簡介：何永梅（1988—），女，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。Tel：18935251120，E-mail：heyongmeiyaner@163.com