MicroRNAs對羊生長發育調控作用的研究進展

林月霞，呂玉華，丁宏林，廖榮榮

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

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MicroRNAs對羊生長發育調控作用的研究進展

林月霞，呂玉華，丁宏林，廖榮榮*

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

摘 要：MicroRNAs（miRNAs）是一類高度保守的、在轉錄后水平調控基因表達的非編碼小RNA分子，miRNAs通過與靶基因的3’端非翻譯區的互補序列結合，抑制靶基因的翻譯，進而調控一系列的生理生化過程，主要包括機體細胞的增殖、分化、凋亡、信號轉導、腫瘤形成等。文章綜述了miRNAs的合成與功能，尤其是近年來miRNAs在羊的皮毛生長、肌肉生長以及卵巢發育等生長發育過程中的研究進展與應用。

關鍵詞：MicroRNAs；山羊；綿羊；生長；調控

MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約為19—24個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因表達的非編碼小RNA分子［1-2］，通過與靶基因的3’端非翻譯區的互補序列結合，形成雙鏈RNA，從而誘導靶mRNA降解或抑制其翻譯過程，參與調控細胞分化、生長、凋亡、代謝等功能［3-4］。LEE等［5］于1993年首次在線蟲（Caenorhabditis elegans）中發現了一種小RNA可以控制Lin-4基因的表達，后來證實這是一類新的具有調控功能的微小RNA——miRNA［6-7］。miRNAs是在各物種里研究最為深入的小非編碼RNA之一。目前，miRBase數據庫（版本21，2014年6月，http://www.mirbase.org/）已經收錄了多種生物的miRNAs達28 645個。大量研究證實miRNAs在生物體的生長、發育和凋亡等過程中具有重要的調控意義［3，8］，在組織細胞中起著極其重要的調控作用，每個miRNAs都有自己特定的靶基因，通常一個miRNA可以調控多個基因，也有幾個miRNAs調控同一個基因的現象，從而在生物體內形成了一個復雜的基因調控網絡。據估測，超過60%的基因受到miRNAs直接調控［9］。越來越多的研究證明，miRNAs在羊的皮毛生長、肌肉生長發育、卵巢發育、神經發育、細胞分化、脂肪代謝等生物過程中發揮著重要作用。本研究聚焦于miRNAs的結構與功能，尤其是近年來miRNAs在羊的皮毛生長、肌肉生長以及卵巢發育等生長發育過程中的調控作用與研究進展。

1　miRNAs的合成與功能

miRNAs通常是由基因間區的DNA序列編碼，或者由非編碼RNA（ncRNA）基因所編碼，也有的miRNAs存在于mRNA前體的內含子中［10］。miRNAs的生物合成是一個較為復雜的多步驟過程（圖1）。首先，在RNA聚合酶II的作用下，miRNAs轉錄成一條較長的具有帽子和多聚腺苷酸結構的初始miRNAs，通常包含幾百甚至是上千條核酸［11］。在細胞核內，這些初始miRNAs在核糖核酸酶III Drosha-DGCR8（DiGeorge syndrome critical region 8）復合體的作用下，形成具有發夾結構的60—100個核苷酸的前體miRNAs，在exportin 5的作用下，前體miRNAs被轉運出細胞核，在RNA酶Dicer作用下，進一步被加工成雙鏈miRNA，然后，解旋酶helicase將雙鏈解鏈，成熟的miRNA便可形成，并整合進入RISC復合體（RNA-induced silencing complex）。成熟的miRNAs可特異性地結合到其靶基因的3’非翻譯區（3’-untranslated region，3-UTR）或mRNA的其他位點發揮功能，進而起到抑制翻譯和（或）降解mRNA的作用，而總體上起到降低蛋白表達水平的功能［3，12-13］。

成熟的miRNAs在進化中大多是相對較為保守的單鏈RNA，其表達具有時空特異性［14］，研究證實，在處于同一發育階段的不同細胞中或不同的發育階段的同一細胞中，miRNAs的表達譜也各不相同，而相同的miRNAs在個體發育的不同階段的表達也是不同的。

圖1　miRNA的生物合成［11］Fig.1 Biosynthesis of miRNA［11］

2　羊miRNAs的分離與鑒定

近年來，通過高通量測序等生物技術手段獲得了大量有關羊的miRNAs。DAVIS等［15］通過對雙肌臀綿羊的骨骼肌樣本進行序列同源比對，首次發現了6個羊miRNAs（miR-431、miR-433、miR-127、miR-434、miR-432和miR-136）。利用芯片技術，ZHANG等［16］對159個miRNAs在成年綿羊和山羊的身體皮膚及耳部皮膚中的表達進行了比較，發現有19個miRNAs大量富集在身體皮膚。隨后，CAIMENT等［17］通過二代測序技術，從雙肌臀綿羊的骨骼肌中鑒定出了747個小RNA，對應到472個miRNAs前體，其中有324個對應到已知的miRNAs，另有148個被認為是新的miRNAs。KHAN等［18］鑒定了172個新的miRNAs基因，分屬于114個家族。MCBRIDE等［19］在不同發育階段羊的卵泡中鑒定了212個miRNAs。CHANG等［20］通過對同日齡的綿羊黃體期卵巢和睪丸的高通量測序研究，共鑒定出267個新miRNAs。

此外，通過計算生物學方法結合實驗方法可以有效地鑒別miRNAs［21］。利用小RNA克隆技術及結合表達序列標簽（EST）信息，SHENG等［22］的研究鑒定了31個羊miRNAs，其中有2個新miRNAs；還克隆了骨骼肌中的12個miRNAs，并對各靶點的表達情況進行了分析。

3　miRNAs在羊皮毛生長中的調控

羊的皮毛是羊的重要的經濟性質，為了解miRNAs在皮膚和毛囊的發育中的作用，LIU等［23］對3頭一歲山羊（一公二母）進行了RNA測序，共檢測到316個miRNAs，其中68個保守的miRNAs是NCBI報道過的（其中有55個是同時匹配到miRBase庫的山羊和綿羊miRNAs的），另外的248個miRNAs是在其他物種內進化上保守的，但是在山羊上未見報道。該研究也確定了22個新發現的山羊miRNAs，還發現一個現象就是在山羊與綿羊中都表達的miRNAs位于各自染色體的相同區段，并且可能在皮膚和毛囊的發育中發揮關鍵作用。

為了解miRNAs在羊毛纖維生長發育中的作用，LIU等［24］研究了miRNAs在藏綿羊毛發生長初期、中期和晚期毛囊中的表達模式，共檢測到244個成熟的miRNAs，其中只有5個是已經被綿羊miRBase庫收錄。進一步研究發現，有204個miRNAs是在哺乳動物進化上保守的，而有35個是首次發現的綿羊特異性的miRNAs。各發育階段的miRNAs表達水平差異顯著，也表明miRNAs可能通過調控不同生物通路的靶基因進而調控羊毛毛囊發育，如MAPK通路和Wnt通路等。此外，有6個miRNAs（oar-miR-103-3p、oarmiR-148b-3p、oar-miR-320-3p、oar-miR-31-5p、oar-novel-1-5p和oar-novel-2-3p）可能通過調控羊毛囊發育關鍵的Wnt通路內基因來控制羊毛發育。

絨山羊70 d胎兒皮膚中的miRNAs相對于2周齡羊羔體側部皮膚表達上調的有4個，下調的則有64個，絨山羊70 d胚胎皮膚中上調的miRNA遠遠少于出生后羊羔皮膚上調miRNAs，這說明miRNAs在絨山羊皮膚毛囊不同發育階段中發揮著關鍵作用［25］。ZHANG等［16］對身體皮膚及耳朵皮膚組織中的159個miRNAs的表達進行了比較，共發現有19個miRNAs大量富集在身體皮膚。這也顯示miRNAs在毛發生長過程中可能也起著重要作用。

通過對miRNAs的研究，進而找出miRNAs的靶基因作用位點是探討miRNAs調控羊皮毛生長的一個途徑。SU等［26］在絨山羊的皮膚和背最長肌中共鑒定了5個新的miRNAs（chi-miR-2284n、chimiR-421*、chi-miR-421、chi-miR-1839和chi-miR-374），通過對潛在的靶基因進行研究，確定了WDR12和CSNK1A1基因參與了Notch/Wnt信號轉導通路并參與對絨山羊毛發生長的調控。

4　miRNAs在羊肌肉生長中的調控

肉類性狀是羊生產中的一個重要的經濟性狀。探討miRNAs對肌肉生長發育的作用具有很重要的意義［27］，已有不少研究報道了miRNAs在不同品種羊的不同發育階段的功能［27-28］。胎兒的肌肉發育受到母體肥胖程度及miRNAs的表達水平的影響。母體肥胖使得let-7 g的表達下調，從而導致了處在肌肉發育期的綿羊胎兒肌內脂肪的增多［29］。

目前，雖然在羊上已經發現了大量的miRNAs，但是，由于一個miRNA可能有幾個靶基因或者是很多個miRNAs在同一時間調控一個基因，所以許多miRNAs的確切的功能還不是很清楚。如何快速而準確地確定miRNAs的靶基因，對研究miRNAs的功能尤為重要。CLOP等［30］研究發現，特塞爾綿羊的Myostatin（MSTN）基因的3’-UTR區域有個G/A突變，該突變會產生miR-1和miR-206的作用靶點，miR-1和miR-206在骨骼肌中的高表達抑制了MSTN蛋白的表達，從而導致肌肉過度生長。

miR-1和miR-133在大多數動物中都是進化上保守的，并且已被證明在小鼠和豬等動物的骨骼肌發育中起著重要作用。在安徽白山羊的研究中，miR-1和miR-133在不同組織中的表達差異較大，其中，在心臟和骨骼肌（背最長肌、胸肌和小腿肌肉）中表達最多，而在肝臟、脾臟、肺和小腸等組織中的表達最少，然而，miR-1和miR-133的靶基因HDAC4和SPF基因的表達則正好相反，這些研究結果表明，miR-1和miR-133可能通過抑制各自靶基因的表達并增強成肌細胞的增殖與分化來影響骨骼肌的生長與發育［31］。

有研究表明，miR-101a富集表達于山羊骨骼肌中，并在骨骼肌衛星細胞的分化期表達上調。轉染miR-101a模擬物，經分化培養基培育后，衛星細胞的分化可以得到促進，并伴隨有肌原性的標志物MyoG 的mRNA的表達上升及MyoD的下降。相反，阻斷miR-101a的功能，則衛星細胞的分化功能將被抑制。由此可知，miR-101a在骨骼肌衛星細胞的增殖與分化中發揮關鍵作用［32］。

5　miRNAs在羊卵巢發育中的作用

卵巢是雌性動物極其重要的生殖器官，研究miRNAs在羊卵巢發育中的作用不僅有助于增強對miRNAs的認識，更有利于探索miRNAs在羊的妊娠生理調控機制及分子育種方面的應用。通過對懷孕及未懷孕的山羊卵巢中miR-184的差異表達分析及生物信息學分析，發現miR-184在山羊的發育、妊娠及細胞生物合成過程中起著重要作用［33］。Chang等通過對同日齡的綿羊黃體期卵巢和睪丸進行高通量測序研究，共鑒定出267個新miRNAs，經熒光定量PCR和Northern blot檢測，其中有一個miRNA（ovis_aries_ovary-m0033_3p）在卵巢和睪丸中均有表達［20］。TORLEY等［34］用熒光定量PCR方法比較了128個miRNAs在不同妊娠日齡（42 d和75 d）綿羊胎兒的卵巢和睪丸中的表達情況，共檢測到24個miRNAs在42妊娠日齡胎兒的卵巢和睪丸中表達差異顯著，而75妊娠日齡時有43個miRNAs在卵巢和睪丸中表達差異顯著。這表明隨著胎兒的發育，miRNAs在不同組織器官中的表達差異明顯。

通過原位雜交技術，TORLEY等［34］揭示miR-22坐落于支持細胞內，可能在胎兒的性別分化及生殖發育過程中起著重要作用。產前睪酮的注射會導致卵巢病變。對妊娠母羊進行睪酮注射，胎兒卵巢中miR-497和miR-15b的表達量將會上調，LUENSE等［35］認為這兩個miRNAs可能在睪酮誘導的卵巢病變中起著一定的作用。對綿羊不同時期卵泡和黃體的miRNAs研究，共鑒別獲得189個已知miRNAs和23個新的miRNAs，其中，miR-21、miR-125b、let-7a以及let-7b表達量最高，占到了所有檢測的miRNAs的40%，并揭示了miRNAs在卵泡向黃體轉化過程中扮演著重要調控者角色［19］。

6　結論與展望

該綜述聚焦于miRNAs在調節羊的重要經濟性狀方面的作用。作為一類重要的調控因子，miRNAs在轉錄后水平調控基因的表達，通過與靶基因的3’端非翻譯區的互補序列結合，抑制靶基因的翻譯，進而調控一系列的生理生化過程。越來越多的研究表明，miRNAs在羊的皮毛生長、肌肉生長、卵巢發育與疾病［36］等生理過程中起著重要的調控作用，這些研究可為提高羊的生產性能和改善健康狀況提供重要的理論依據。

未來，miRNAs與羊生產性能的關系將會得到更多的研究，特別是在miRNAs的mRNA靶位點的確定方面會有更多進展。地方品種的特異性的miRNAs也是一個研究方向，可以探討將miRNAs作為特異地方品種的生物標志。研究品種特異性的miRNAs或者miRNAs靶基因的變異也非常有利于羊的經濟性狀的育種。腸道微生物是動物生產性能與健康的重要影響因素，未來，miRNAs對宿主和腸道微生物互作的調控作用的研究將會受到重視。全基因組關聯分析（GWAS）越來越多地應用于家畜經濟性狀的研究中，結合miRNAs的GWAS將會更好地運用于miRNAs的靶基因突變研究，并促進家畜經濟性狀的開發利用和健康的改善。

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（責任編輯：張睿）

Research progress on MicroRNAs in regulating the growth and development of goat and sheep

LIN Yue-xia，Lü Yu-hua，DING Hong-lin，LIAO Rong-rong*
（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：MicroRNAs（miRNAs）are important regulators in biology.MiRNAs are a class of small noncoding RNAs that target mRNAs for translational repression or degradation.MiRNAs target mRNAs by base-pairing with the 3’-untranslated regions（3’-UTRs）of mRNAs.MiRNAs have been shown to play roles in many biological processes，including cell proliferation，differentiation，apoptosis，signal transduction and ontogenesis.The paper summarizes the identification，expression，and function of miRNAs in two important farm animal species：goat and sheep，highlights the potential role of miRNAs in regulating economically important traits，such as skin，hair，muscle and ovary.

Key words：MicroRNAs；Goat；Sheep；Growth；Regulation

中圖分類號：S826

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-172-05

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.34

收稿日期：2016-04-01

基金項目：上海市科技興農推廣項目［滬農科推字（2014）第3-1號］；上海市科委項目（15391912901）

作者簡介：林月霞（1978—），女，碩士，助理研究員，研究方向：動物營養與功能基因組學。E-mail：lyxia05@163.com

*通信作者：廖榮榮（1985—），男，博士，助理研究員，研究方向：動物功能基因組學及其應用。E-mail：lrrnd@163.com