體細胞克隆技術及其存在的問題

張德福，戴建軍，吳彩鳳，張樹山

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所；上海市農業遺傳育種重點實驗室/動物遺傳工程研究室，上海201106）

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體細胞克隆技術及其存在的問題

張德福，戴建軍，吳彩鳳，張樹山

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所；上海市農業遺傳育種重點實驗室/動物遺傳工程研究室，上海201106）

摘 要：闡述了體細胞克隆技術在生命科學和畜牧業中應用的重大價值，該技術是當今生物技術中最重要的研究領域之一，但還存在著一些問題；詳細分析、討論了目前克隆技術存在的問題。

關鍵詞：克隆技術；生命科學；畜牧業；問題

動物克隆技術的研究和應用是當代生命科學與生物技術研究的熱點之一，是衡量一個國家生命科學科研水平的重要標志。自首例體細胞克隆羊誕生以來，克隆技術以其無可比擬的優勢在畜牧業生產、醫藥學研究、再生醫學及基礎生物學研究中發揮著巨大的作用，具有廣闊的應用前景。

自1998年起本實驗室在豬體細胞克隆技術上進行了深入研究，特別是在利用克隆技術保存地方豬種種質資源及生產轉基因豬方面取得了一批研究成果［1-5］，也對克隆技術的應用前景進行了大量的介紹［6-8］；在此過程中也發現克隆技術依然存在著一些亟待解決的問題［9-13］。結合近二十年來本研究團隊的相關研究結果，本文對目前克隆技術存在的問題進行分析探討，以期為該技術的進一步健康發展提供借鑒。

1　克隆效率低

克隆技術目前存在的最大問題是克隆效率低。所謂克隆效率通常是指克隆胚胎（或稱重構胚胎）經胚胎移植到受體（即代孕母體）后獲得的克隆動物個體比例。有學者詳細統計分析了牛、山羊、綿羊和小鼠的克隆效率，牛的克隆效率相對較高為10%—20%，山羊為3%—5%，綿羊為3%—10%，豬為0.5%—3%，小鼠為4%—5%［14］。克隆動物常常出現所謂的“三高”，即克隆胎兒流產率高、圍產期死亡率高、新生動物死亡率高，是導致體細胞克隆效率低下的主要原因。HILL等［15］克隆了13頭牛，4頭于胎兒期流產，3頭于出生時或出生后死亡；WELLS等［16］將988枚克隆胚胎移植到受體后，有133頭克隆牛出生，出生1 d后死亡率高達21.8%，3月齡內死亡率為14.4%，只有63.8%的犢牛存活超過3個月。本實驗室在克隆豬上的研究表明，大部分克隆豬胎兒在妊娠2個月前后發生流產［9］。

可以看出，從克隆胚胎到克隆胎兒直至克隆新生動物各個階段的發育都不同程度地受到影響，使克隆效率十分低下，加上克隆動物的生產成本非常昂貴，使克隆技術的推廣應用受到了極大的影響。

2　克隆動物胚胎、胎兒發育異常

2.1克隆動物胚胎發育異常

牛克隆胚胎移植后，在妊娠的前3個月內，胎兒死亡及流產的比例很高。與體內/體外受精胚胎相比，大量的克隆胚胎不能正常發育。早期胚胎損失發生的原因較多，如胎兒畸形或胎盤發育不正常、母體子宮或激素環境異常、胎兒-母體相互排斥等。有研究者［17］對牛體細胞克隆胚胎的發育異常進行了較為系統的研究，將牛異常后代綜合癥（AOS，abnormal offspring syndrome）分為4類（表1）。

表1　牛異常后代綜合癥分類Table 1 Category of bovine abnormal offspring syndrome

2.2克隆動物胎兒的巨胎癥

當體細胞克隆胚胎的細胞核重構或重編程不完全時，就會引起基因表達的異常，從而導致胎盤和胎兒的發育異常，造成的后果通常是形成巨胎癥（LOS，large offspring syndrome）［18］。在妊娠期，巨胎癥的明顯特征是尿囊增大、乳腺發育缺失和妊娠期延長等。在出生時，典型的特征是體重特別大、器官大小異常、喪失運動神經調節、大舌頭等。巨胎癥在克隆牛上最為突出，在克隆羊、克隆小鼠中也普遍存在；但在克隆豬上，迄今尚未發現有此癥狀。

2.3克隆動物胎兒胎盤發育異常

一般克隆胚胎有30%—50%可以發育到囊胚期，與體外受精的胚胎沒有太大的差異（30%—40%）。但大部分克隆胚胎在附植后停止發育，能夠發育到出生的克隆胚胎僅有1%—5%，遠遠低于體外受精胚胎（30%—60%）［19］。

胎盤發育異常與克隆胎兒妊娠過程中死亡密切相關。胎盤是哺乳動物胚胎發生過程中特有的器官，是母體與胎兒氣體、營養及代謝廢物交換的主要場所；此外胎盤也分泌一些與妊娠相關的激素、生長因子以及胎兒免疫蛋白等。克隆動物常常出現胎盤肥大現象，但可用于母體和胎兒進行物質交換的部位卻有所減少，致使胎盤功能無法正常發揮。

胎盤發育異常是目前克隆動物普遍存在的問題。在克隆小鼠、牛、羊和豬中均有克隆胎兒胎盤發育異常的報道。克隆牛中，胎盤發育異常多發生在胎盤小體上。研究顯示，克隆牛胎兒從30 d到90 d的發育過程中，胎盤的血管發育和胎盤子葉數目都有所減少，一些胎盤含有異常的絨毛上皮和血管化程度低的尿囊。上述胎盤發育的缺陷是導致克隆牛早期胎兒流產的重要原因［20］。也有研究顯示，克隆牛胎兒胎盤的異常發育還會引起MHC的異常表達從而引起母體對克隆胎兒的排斥，大大增加流產率［21］。

3　克隆動物的發育缺陷

克隆動物死亡率較高，以克隆牛為例，有些新生克隆牛犢初期看似挺健康，但到青年或成年后出現異常。

李世杰等［22］在新生死亡的9頭克隆牛中均發現器官發育異常，包括心臟肥大、右心室增大、卵圓孔閉合不全以及瓣膜發育不全等；肝發育異常主要表現為肝腫大和充血；肺發育異常主要表現為出生時肺未充起以及肺形態發育異常。徐金霞等［23］也發現1例死亡克隆牛腦和免疫器官組織異常。另外，由于免疫力和抗體水平低，也增加了克隆動物感染和發病的可能性，因此新生克隆牛易患腸炎、臍帶感染和呼吸道感染。

RENARD等［24］以耳成纖維細胞為供體獲得克隆牛，出生1.5個月后死于貧血，尸體解剖發現脾臟、胸腺和淋巴結等淋巴組織都沒有得到正常發育。本實驗室［9］對新生死亡克隆豬的5種組織進行詳細的組織病理學觀察，結果發現：克隆豬肺臟表現為典型的肺不張，肺泡壁有明顯充血；肝臟的肝細胞形態異常，肝索紊亂，無典型肝小葉結構；腎臟的腎小球處于不同發育階段，腎小管管腔尚未形成，僅有腎小管輪廓；另外在獲得的克隆豬中也發現個別公豬出現隱睪癥狀。

4　克隆效率低下的原因分析

在體細胞克隆中，供體核來自于高度分化的體細胞。在分化過程中，體細胞核獲得了高度特異的DNA和染色質的表觀遺傳修飾（epigenetic modification），導致了分化狀態的細胞記憶。由于供體核支持克隆胚胎的發育，因此當供體細胞核放至去核的卵母細胞后，供體核必須經過表觀遺傳修飾的重編程（reprogramming），激活對胚胎早期發育有重要作用的基因，并抑制與分化相關基因的表達，從而獲得發育的全能性［25］。目前認為，供體核的不完全編程導致在發育過程中有重要的基因沒有表達或異常表達，是克隆效率低的主要原因［26］。

為探求新生克隆豬可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重編程，本實驗室運用亞硫酸氫鹽測序法分別檢測了H19基因和IGF2R基因差異甲基化區域（DMR）在新生死亡克隆豬和同期正常豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的甲基化狀態［27］。結果發現，H19基因DMR在克隆豬肺臟中表現為超甲基化，極顯著高于正常豬（95.20%vs 46.80%，P＜0.01），且10個測序克隆中存在2處連續的全甲基化CpG位點（4—9位，12—S17位），而在其他組織中甲基化差異不顯著（P＞0.05）；IGF2R基因DMR在肝臟中處于超甲基化狀態，顯著高于正常豬（80.00%vs 39.41%，P＜0.05），而在肺臟中為去甲基化狀態，極顯著低于正常豬（14.71%vs 66.47%，P＜0.01），在其他組織差異不顯著（P＞0.05）。表明在死亡克隆豬中，H19基因在肺臟和IGF2R基因在肝臟與肺臟中存在不完全的DNA甲基化重編程，這可能是導致克隆動物死亡的原因之一。

為查明本課題組所獲得的2頭克隆豬隱睪發生的原因，采用相對熒光定量PCR技術和亞硫酸氫鹽測序法分析檢測了WT1、FGF9、SOX9和INSL3基因在克隆豬隱睪中的表達量及其啟動子區CpG位點甲基化狀態。結果表明：WT1基因異常表達、睪丸組織FGF9、INSL3基因DNA甲基化重編程異常，是導致克隆豬發生隱睪的重要因素［10-11］。進一步利用雙向電泳-質譜體系的比較蛋白質組學技術進行分離和鑒定，并結合生物信息學手段對部分差異蛋白進行功能分析［28］，發現克隆巴馬小型豬的心臟蛋白共有11個差異蛋白，其中5個為上調蛋白，6個為下調蛋白［12］；肺臟蛋白共有31個差異蛋白，其中23個為上調蛋白，8個為下調蛋白［13］。從而在蛋白質水平上證實：克隆巴馬小型豬的心肺均存在一定程度的功能失調。

中國農業大學李寧教授課題組的相關研究也顯示，克隆牛的一些功能基因DNA甲基化、組蛋白乙酰化都發生不同程度變化［29-30］。

總的來說，供體細胞核重編程的異常普遍存在于克隆胚胎和克隆動物中，是引起體細胞克隆效率低的主要原因。因此，如何提高供體細胞核的重編程是一個亟待解決的問題。

5　細胞質遺傳問題

眾所周知，動物的遺傳信息主要儲存在核DNA上，但還有微量的遺傳信息包含在線粒體中。線粒體DNA經過卵母細胞胞質的分配而呈母系遺傳方式。在體細胞克隆過程中，供體細胞通過融合進入受體細胞質后，在將核DNA導入卵母細胞的同時，也把供體細胞的線粒體DNA隨之帶入。因此克隆胚胎中存在受體和供體兩種來源的線粒體DNA，這兩種來源的線粒體DNA在克隆胚胎隨后發育過程中的命運怎樣？以及對克隆胚胎發育的潛在影響究竟如何？這些問題已引起有關研究者的注意［30］。STEINBORN等［31］在體細胞克隆牛的不同組織中發現了供體細胞和受體細胞線粒體DNA共存的現象，但二者線粒體DNA所占比例從克隆前到克隆后整個發育過程基本保持不變，供體線粒體DNA約占1%。線粒體DNA的異質性似乎并不影響克隆牛的正常發育，但線粒體DNA與核DNA之間的不協調是否是造成克隆胚胎活力低下的原因之一還有待進一步研究。

此外，在小鼠和牛的克隆研究中，還發現細胞質的遺傳物質影響克隆后代的表型，如花斑、毛色等；本實驗室在克隆巴馬小型豬上的研究中也發現，來自同一供體細胞系的克隆同胞背部花斑不完全一致。這是由供體細胞線粒體DNA還是由卵子細胞質中的遺傳物質引起的目前尚不清楚。

迄今為止，人們雖然在克隆技術的研究上積累了一些經驗，使克隆效率有了一定的提高，但克隆機理的探明才是解決克隆效率的關鍵所在。動物克隆技術是一項系統工程，需要由分子遺傳學、發育生物學、細胞學等相關基礎學科提供可靠的理論指導與技術支持［32］，否則很難再進一步提高體細胞克隆效率。目前，許多新興的研究方法如生物芯片、二維凝膠電泳和質譜技術已應用于動物克隆機理的研究之中。通過對表觀遺傳的分析，期望能夠揭示克隆動物表觀遺傳的分子機制，以進一步提高克隆效率。

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（責任編輯：閆其濤）

Animal somatic cell cloning technique and its problems

ZHANG De-fu，DAI Jian-jun，WU Cai-feng，ZHANG Shu-shan
（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Division of Animal Genetic Engineering，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106，China）

Abstract：Animal somatic cell cloning technique，with its great value in life science and animal husbandry，is one of the most important research fields in current bio-technology.However，there are still some problems.The paper here briefly reviewed and discussed the problems in animal cloning technique in detail.

Key words：Cloning technique；Life science；Animal husbandry；Problems

中圖分類號：S814.8

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-168-04

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.33

收稿日期：2016-01-14

基金項目：國家自然科學基金（31372315）；國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08006-005、2014ZX08006）；上海市科委農業成果轉化專項（123919N0700、133919N1700）

作者簡介：張德福（1963—），男，博士，研究員，研究方向為動物胚胎工程。Tel：021-62200389，Fax：021-62207858，E-mail：zhangdefuzdf@ 163.com.cn