人類多效生長因子Pleiotrophin的原核表達

李 紅，劉成倩，易建中

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

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人類多效生長因子Pleiotrophin的原核表達

李 紅，劉成倩，易建中*

（上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海201106）

摘 要：根據GenBank上公布的Ptn核苷酸序列設計1對引物，利用RT-PCR的方法擴增出人類Ptn基因，將其克隆到原核表達載體pET-30a上，得到重組質粒pET-30a-Ptn。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞并進行表達條件優化，經SDS-PAGE電泳及Western Blotting分析表明，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃條件下誘導3 h表達量最高，其分子質量約24.9 kD，表達產物主要以包涵體形式存在，且表達的融合蛋白能與His標簽單克隆抗體發生特異性反應。

關鍵詞：Pleiotrophin；原核表達；條件優化

Pleiotrophin（PTN）最早是1989年Bohlen等［1］從成體牛腦中分離純化出的一種可與肝素結合的蛋白質，稱為多效生長因子。Ptn基因在牛、鼠、人和雞之間高度保守［2］，是目前已知的所有生長因子中最保守的一種基因。Ptn基因的表達產物是一種具有分泌性和多效生長因子作用的蛋白，在細胞的生長、分化及發育過程中均起重要作用［3］。研究表明，PTN具有刺激細胞增殖及遷移、細胞轉化、促進血管生成、促進神經細胞的轉化/軸突生長、腫瘤的生長、炎癥反應、創傷修復、胚胎發育和參與骨發育等功能［4-9］。多種因子或化學物質如：成纖維生長因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板源生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、激素、一氧化氮（NO）都可以調節PTN的表達。PTN表達也可被炎癥中的巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞及缺血損傷部位的其他細胞上調［5］。外源Ptn基因導入可使NIH3T3細胞、SW13細胞發生惡性轉化。因此，PTN作為腫瘤治療的潛在分子靶點日益受到關注［10-11］。

甲型H1N1流感在全球肆虐至今，人獸共患傳染病的抗擊和防治再次成為公眾關注焦點。最早發現于牛腦的多效生長因子PTN雖然在動物中研究不多，但其基因的高度保守以及多功能性，啟發畜牧業科研人員對其功能進行探討。PTN在健康組織中很少表達，但在多種腫瘤組織及血清中表達量明顯增高。本試驗借助一個難得的實驗模型人肝胚細胞瘤細胞系HePG2，利用RT-PCR技術，構建了表達人類PTN的原核載體，并對PTN重組蛋白的表達條件進行優化，以期為深入研究PTN蛋白的結構和功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1菌種、載體及主要試劑

人肝腫瘤細胞系HepG2、E.coli TOP10感受態細胞及表達菌株E.coli（BL21）均由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所禽病研究室保存；質粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；T4連接酶、rTaq DNA聚合酶、反轉錄酶、反轉錄酶抑制劑、KOD酶、DNA Marker、pMD18-T載體均由大連寶生物工程有限公司提供；限制性內切酶BamHI、HindIII購自NEB公司；蛋白質Marker和TRN-zol-A+總RNA提取試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2引物設計

根據GenBank上公布的Pleiotrophin基因的全長序列，由Primer 5.0軟件設計出1對特異性引物，上游引物Pleiotrophin-F：5’-ATACGGGATCCATGCAGGCTCAACAGTACCA-3’（下劃線處為BamHI酶切位點），下游引物Pleiotrophin-R：5’-AGTGCAAGCTTTTAATCCAGCATCTTCTCCTGT-3’（下劃線處為HindIII酶切位點），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3RT-PCR擴增

提取HePG2細胞系的總RNA。cDNA合成反應條件（10 μL）為：總RNA 4 μL，Pleiotrophin-R引物1 μL，dNTP 1 μL于PCR管中65℃5 min，冰上迅速冷卻2 min，離心。5×Prime Script Buffer 2 μL，Prime script RTase 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，H2O 1 μL，42℃水浴1 h，立即放到冰上冷卻。RT-PCR反應條件（50 μL）為94℃5 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，35個循環；72℃10 min。反應結束后，使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。回收PCR產物，根據pMD18-T載體說明書連接獲得重組質粒pMD18-T-Ptn。

1.4Ptn基因原核表達載體的構建和鑒定

利用限制性內切酶BamHI和HindIII分別對Ptn基因PCR產物和表達載體pET-30a進行雙酶切，將純化回收后的PCR產物與表達載體pET-30a連接，連接物轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞。通過菌落PCR篩選出含有目的基因的重組菌落，將其命名為pET-30a-Ptn，此菌經LB液體培養基培養12 h后送上海華大基因科技股份有限公司測序。

1.5PTN蛋白誘導表達

將測序正確的菌落pET-30a-Ptn抽提質粒，轉化Transetta（BL21）感受態細胞，培養過夜，挑取單菌落，接種于3 mL含Kam的LB液體培養基中，37℃活化過夜后，1∶100稀釋到含Kam的LB液體培養基中，37℃200 r/min振搖培養至對數生長期OD600為0.5—0.8，加入終物質的量濃度為0.5—1.0 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振搖誘導培養3—7 h后收集菌體，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。

1.6稀有密碼子及密碼子適應指數CAI值分析

利用在線分析網站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html及在線分析CAI值網站http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis分別對擴增的Ptn基因稀有密碼的個數及CAI值進行分析。

1.7重組蛋白可溶性分析

挑取陽性重組菌的單菌落，接種于3 mL含Kam的LB液體培養基中，37℃培養過夜，然后1∶100稀釋接種到100 mL含Kam的LB液體培養基中；37℃200 r/min振搖培養至對數生長期OD600為0.5—0.8，加入終物質的量濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37℃200 r/min振搖誘導培養3 h后收集菌體，將菌體用15 mL PBS洗2次，然后用PBS懸浮細菌，經超聲波裂解，12 000 r/min離心15 min，沉淀也用15 mL PBS溶解，分別取適量超聲后上清和沉淀加5倍上樣緩沖液，煮沸裂解5 min，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。

2　結果與分析

2.1HepG2細胞Ptn基因PCR擴增

以提取的總RNA為模板進行反轉錄，以Pleiotrophin-F/Pleiotrophin-R為引物進行PCR擴增，得到大小為529 bp的片段（圖1），與預期結果一致。

2.2重組原核表達載體的篩選與鑒定

pMD18-T-Ptn與原核表達載體pET-30a酶切連接后，挑取10個單菌落進行菌落PCR篩選。由圖2可知，挑取的10個菌落有7個是陽性，3個是陰性。取陽性菌落進行測序，序列沒有發生突變和移碼。

圖1　HepG2細胞Ptn基因擴增結果Fig.1 Amplification results of Ptn gene from HepG2 cells

圖2　pET-30a-Ptn菌落PCR篩選結果Fig.2 PCR results of pET-30a-Ptn

2.3Ptn基因稀有密碼子分析及CAI值分析

利用稀有密碼子在線分析網站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html對Ptn基因進行分析，結果顯示：序列內含有18個稀有密碼子，18個稀有密碼子于序列中分布比較均勻。通過在線分析軟件（http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis）進一步對Ptn基因序列進行分析，密碼子適應指數CAI（codon adaptation index）值為0.65，CG含量為51.83%（圖3）。軟件提示CAI值大于1.0或CG含量30%—70%則利于基因的高效表達，Ptn基因雖然CAI值小于1.0，但CG含量為51.83%且稀有密碼子分布均勻，利于其蛋白的表達。

圖3　Ptn基因CAI和GC含量分析Fig.3 Analysis of codon adaptation index（CAI）and GC content of Ptn gene

2.4重組菌誘導表達及重組蛋白可溶性分析

重組菌pET-30a-Ptn誘導后，經SDS-PAGE電泳分析，所得重組蛋白的分子質量約為24.9 kD（圖4），與預期結果相同。IPTG為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L對PTN蛋白質誘導沒有太大差異。3 h、5 h和7 h分別誘導出目的蛋白，發現3 h表達量高一些。重組菌體pET-30a-Ptn超聲裂解后，經SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白主要在超聲后的沉淀中，表明此蛋白主要以包涵體形式存在。

2.5重組蛋白的Western Blotting分析

超聲后的菌體沉淀經SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜后，在24.9 kD處出現目的條帶（圖5），結果表明重組蛋白能與His標簽單克隆抗體發生特異性反應。

圖4　PTN重組蛋白表達的SDS-PAGE檢測結果Fig.4 SDS-PAGE results of PTN recombination protein

圖5　PTN重組蛋白Western Blotting分析結果Fig.5 Western Blotting results of PTN recombination protein

3　結論與討論

大腸桿菌原核表達系統適合多種原核基因以及一些真核基因的表達。然而，外源蛋白的表達水平與多種因素有關。其中，密碼子的使用頻率差異是影響外源蛋白表達效率的因素之一。Ptn基因雖然含有18個稀有密碼子，但由于稀有密碼子分布比較均勻，沒有連續出現，而對其表達影響不大。CAI值小于1.0時，不利于目的蛋白表達，但是目的基因GC含量在50%左右，則利于蛋白的表達。因此，目的蛋白要想成功表達，需考慮多個因素，可以借助生物信息學，通過實驗驗證，確立最佳表達條件。

本研究通過構建Ptn基因的原核表達載體pET-30a-Ptn，實現其在E.coli（BL21）中的高效表達，并對融合蛋白重組表達的主要因素進行了優化，確定了誘導表達的條件。誘導劑IPTG的用量、誘導溫度和誘導時間等對PTN的表達量都有一定影響，融合蛋白在0.5 mmol/L IPTG、37℃條件下誘導3 h表達量最高。由于重組蛋白含有多聚組氨酸，可以與Ni-NTA瓊脂糖顆粒結合，因此可以利用Ni-NTA進行蛋白的親和純化。

PTN在胎兒分娩時表達達到高峰，之后，隨著組織器官發育成熟而逐漸降低［4］。成人僅在腦、舌及子宮中可檢測到［12］。但值得重視的是，PTN蛋白存在于多種腫瘤組織及血清中［13-14］。HepG2是一種分化好的人肝胚細胞瘤細胞系，保留了較完整的代謝酶及其活性［15］，為順利克隆Ptn基因提供了素材。Ptn基因作為一個原癌基因，與腫瘤的發生發展關系緊密，其表達水平可以作為腫瘤診斷、治療、預防評價的指標。Pleiotrophin基因在人、牛、雞和鼠之間高度保守，是目前細胞因子中氨基酸序列保守程度最高的蛋白，為此從HepG2細胞系中克隆此細胞因子對研究家禽畜牧業中雞腫瘤疾病有一定的啟發和促進作用。

本研究根據Ptn的基因序列，通過RT-PCR技術，獲得了HepG2細胞Ptn基因，并構建了Ptn基因的原核表達載體pET30a-his-Ptn，優化了其誘導條件，在大腸桿菌在實現了高效表達，成功純化了重組PTN蛋白。

參 考 文 獻

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（責任編輯：閆其濤）

Prokaryotic expression of human multieffect growth factor Pleiotrophin

LI Hong，LIU Cheng-qian，YI Jian-zhong*
（Institute of Animal Husbandry & Veterinary Science，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：According to the relevant sequence from GenBank，the specific primers were designed for amplifying Ptn gene by RT-PCR method.The Ptn gene was cloned into prokaryotic expression vector to construct the recombinant expression plasmid pET-30a-Ptn.The fusion protein was expressed in E.coli（BL21）and the induction conditions for expression were optimized.The high yield of fusion protein was achieved with 0.5 mmol/L IPTG，37℃for 3 hours.The 24.9 kD expressed protein of PTN was identified by SDS-PAGE and Western Blotting.The protein existed mainly in the form of inclusion body and could react specificly with His-tag monoclonal antibody.

Key words：Pleiotrophin；Prokaryotic expression；Optimization

中圖分類號：S85

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-067-05

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.14

收稿日期：2015-09-14

基金項目：上海市科技人才計劃（14YF1414600）

作者簡介：李紅（1983—），女，博士，助理研究員，主要從事動物分子生物學和免疫學的研究。Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029 @163.com

*通信作者，Tel：021-62204612，E-mail：yijianzhong@yahoo.com