香菇工廠化栽培中常見霉菌的分離鑒定及抑菌劑篩選

朱曉玲，章爐軍，張俊玲，譚 琦，尚曉冬*

（1上海市農業科學院食用菌研究所/國家食用菌工程技術研究中心，上海201403；2南京農業大學生命科學學院，南京210095）

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香菇工廠化栽培中常見霉菌的分離鑒定及抑菌劑篩選

朱曉玲1，2，章爐軍1，張俊玲1，譚 琦1，2，尚曉冬1*

（1上海市農業科學院食用菌研究所/國家食用菌工程技術研究中心，上海201403；2南京農業大學生命科學學院，南京210095）

摘 要：為了明確香菇工廠化栽培中污染霉菌的優勢種，對分離的49株常見霉菌進行鑒定，并針對優勢種進行抑菌劑試驗，篩選出綠色高效的抑菌劑。顯微形態鑒定和ITS序列分析的鑒定結果表明：香菇工廠化栽培培養料中的霉菌優勢種有：哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、短密青霉和總狀毛霉，其分離頻率分別為57%、25%、4%、6%和8%。H2O2、中生菌素和克霉靈對除短密青霉外的4種霉菌的菌絲抑制效果由強到弱依次為：H2O2、中生菌素和克霉靈，對5種霉菌的孢子萌發抑制作用由強到弱依次為：H2O2、中生菌素和克霉靈；這些抑菌劑中，H2O2的安全性最高，中生菌素次之。為制定香菇工廠化污染霉菌優勢種的控制方案提供參考。

關鍵詞：香菇；工廠化栽培；霉菌；鑒定；抑菌劑

目前，香菇栽培模式亟待轉型升級，設施和工廠化栽培受到越來越多的關注，也掀起了香菇工廠化栽培研究的熱潮，其中尤以香菇工廠化壓塊模式最受關注。霉菌污染一直是香菇工廠化壓塊模式中需要重視的的問題，污染會發生在栽培的任何時期，發菌期是菌塊最易受到霉菌侵染的時期，嚴重的霉菌污染會給栽培帶來巨大損失甚至絕收［1］。其中，尤以木霉污染最為嚴重［2］，木霉可通過溶壁、纏繞等方式作用香菇菌絲細胞壁［3］，并產生毒素抑制菌絲的生長［4-5］。青霉和毛霉亦有分解有機物和產生毒素的能力［6］，與香菇菌絲競爭營養與水分。近年來，國內外相關研究人員針對霉菌污染問題進行了相關報道，覃培升等［7］對平菇栽培料中的木霉、青霉特性進行了研究，王剛正等［8］研究了植物提取液對食用菌中木霉菌的抑制作用，Park等［9］利用分子標記分析平菇中的污染雜菌，Johanna等［10］研究了木霉的生長特性，但目前還未有關于防控香菇工廠化栽培中的污染菌的研究。在霉菌的防控方面，使用農藥造成的藥劑殘留會對人體、環境等產生諸多危害。因此，本研究對引起香菇工廠化栽培料污染的雜菌進行分離鑒定，并進行抑菌劑篩選，旨在找出污染霉菌優勢種，篩選出綠色高效的抑菌劑，為制定控制方案提供科學參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

乳酸酚棉藍染色液（卓越生物實驗器材），40%克霉靈可濕性粉劑（湖北省隨州市隨緣食用菌消毒劑廠），3%中生菌素可濕性粉劑（深圳譜諾信農化股份有限公司），30%H2O2（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2供試香菇菌株

香菇‘申香F2’（Lentinula edodes‘Shenxiang F2’），上海市農業科學院食用菌研究所選育。

1.1.3培養基

PDA培養基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

PDB培養基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2霉菌的分離鑒定

1.2.1樣品采集

上海國森生物技術公司香菇工廠化栽培菇房中，在栽培瓶中發滿并經過一段時間后熟期的培養料，重新壓塊后被雜菌侵染，從25塊受污染的壓塊上隨機采集污染菌塊，4℃冰箱中保存備用。

1.2.2分離純化

從采集的菌塊上挑取霉菌孢子，25℃，PDA平板上培養3 d，待長出菌落后立即純化培養［11］，純化2—3次，純化菌株依次編號。

1.2.3形態學鑒定

25℃避光條件下，PDA平板上倒置培養3—7 d，觀察描述菌落特征。與此同時，待菌落上可以觀察到明顯的綠色孢子時，挑取菌絲制片，用乳酸酚棉藍染色液染色，根據分生孢子梗的形態特征及分生孢子的形態大小進行鑒定［12-14］。

1.2.4ITS序列分析

用特制接種針將霉菌菌塊接種于裝有100 mL PDB培養基的250 mL三角瓶中，25℃，120 r/min振蕩培養3 d。挑取適量菌絲于研磨管中，冷凍干燥12 h，研磨充分，然后用CTAB［15-16］提取總DNA。PCR擴增，真菌通用引物對為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；擴增程序為：94℃3 min，94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，35個循環，72℃10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在凝膠成像系統上觀察并記錄結果。PCR擴增產物交送生工生物工程股份有限公司完成測序。

1.2.5構建系統發育樹

根據步驟1.2.4的測序結果，利用NCBI數據庫進行同源性對比，鑒定到種［17］。GeneBank中下載已知序列與測得的序列進行比對，利用MEGA 5.10計算菌株之間的遺傳距離，構建系統發育樹。

1.3抑菌劑的篩選

選取克霉靈、中生菌素、H2O23種抑菌劑，從霉菌、香菇菌絲和孢子的抑制效果考察3種抑菌劑的抑制作用。

1.3.1菌絲生長抑制作用的測定

3種抑菌劑用無菌水配制成各種不同濃度的母液，加入滅菌后冷卻至50℃左右的PDA培養基中，充分搖勻后倒入培養皿中制成平板，以培養基中加等量無菌水作為對照。克霉靈、中生菌素、H2O2的試驗濃度范圍分別為：40—2560 mg/L、1.05—67.2 mg/L、0.1—6.4 mg/L，各7個梯度，2倍濃度梯度差。

1.3.2孢子萌發抑制作用的測定

采用凹玻片懸滴法［1］測定3種抑菌劑對霉菌孢子萌發的抑制作用，每隔4 h鏡檢1次，當空白對照組中的孢子萌發率達到90%以上時，統計各試劑處理組孢子萌發情況。3種抑菌劑的試驗濃度范圍與菌絲抑制試驗相同。

1.3.3數據處理

將抑制率轉化為幾率值，濃度轉化為對數值，利用SPSS 19.0軟件進行數據分析，得到毒力回歸方程，求出EC50和EC90，比較幾種殺菌劑的抑制效果。

2　結果與分析

2.1形態學鑒定

經分離、純化等步驟共獲得49株霉菌，從1—49依次編號，形態學鑒定初步將分離到的49株霉菌菌株劃分為5個種，分別為哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉、短密青霉。污染往往不是單一的，同一污染壓塊上有2—3種霉菌并存。5種霉菌的形態學鑒定結果如下：

哈茨木霉（T.harzinum）：生長迅速，菌落生長初期呈絨毛狀，有明顯的同心圓環狀產孢區，隨著菌絲的老熟，顏色由淡綠色變為暗綠色，培養基反面同色。菌絲有隔膜，分生孢子梗呈樹狀，有二級分支，瓶狀小梗基部細，中間膨大，頂部變細。分生孢子呈球狀，由小梗相繼生出，孢子直徑2—3 μm（圖1）。

圖1　哈茨木霉培養皿上著生狀態及顯微形態觀察Fig.1 Status on culture dish and microstructure morphology of T.harzinum

側耳木霉（T.pleuroticola）：菌絲長速快，生長初期菌絲呈棉絮狀，菌絲致密平坦，有明顯的同心圓產孢區，顏色隨著菌絲老熟由淡黃色最后轉化為深黃綠色，培養基背面呈黃色。菌絲有隔膜，分生孢子梗有三級分支，對生。分生孢子呈球狀，由小梗頂端相繼生出，孢子直徑2—3 μm（圖2）。

深綠木霉（T.atroviride）：生長速度慢于哈茨木霉和側耳木霉，菌絲呈絮狀，新生長的產孢區為白色，老產孢區為深綠色，菌落反面無色或呈淡黃色。菌絲有隔膜，分生孢子梗有分枝，對生或互生，瓶梗細長，呈窄安瓿形，樹狀排列。分生孢子呈球狀或橢球狀，由小梗頂端相繼生出，孢子直徑為2—3 μm（圖3）。

短密青霉（P.brevicompactum）：菌絲生長不蔓延，為局限性菌落，中央厚，凸起，質地呈絨狀，有輻射狀溝紋，外層新生菌絲白色，中央產孢區由淡青色轉為青灰色，反面同色。菌絲有隔膜，分生孢子梗頂端膨大，帚狀，二級或三級分支，瓶梗呈安瓿形，排列緊密。分生孢子球形或橢球形，孢子直徑為2—3 μm（圖4）。

總狀毛霉（M.racemosus）：菌絲生長速度快，在培養基上可長到1—2 cm高，初期呈絨毛狀，顏色為白色，后期變為淡褐灰色，部分菌絲上生長出褐色孢子。培養基反面為淡褐灰色。菌絲無隔膜，孢子梗總狀分枝，孢子囊為橢球形，成熟時孢子囊壁消解，釋放孢子，孢子呈近球形，無假根和囊托（圖5）。

圖2　側耳木霉培養皿上著生狀態及顯微形態觀察Fig.2 Status on culture dish and microstructure morphology of T.pleuroticola

圖3　深綠木霉培養皿上著生狀態及顯微形態觀察Fig.3 Status on culture dish and microstructure morphology of T.atroviride

圖4　短密青霉培養皿上著生狀態及顯微形態觀察Fig.4 Status on culture dish and microstructure morphology of P.brevicompactum

圖5　總狀毛霉培養皿上著生狀態及顯微形態觀察Fig.5 Status on culture dish and microstructure morphology of M.Racemosus

2.2分離頻率

根據2.1形態學鑒定結果統計分析49株霉菌的分離頻率，詳細信息見表1。

表1　各霉菌分離頻率Table 1 Separation frequency of various molds

2.3ITS鑒定

49株霉菌經ITS-PCR后均擴增出一條大小相近的條帶，500—600 bp，條帶較清晰，可用于后續測序工作，部分電泳結果見圖6。

圖6　部分霉菌的ITS-PCR電泳圖Fig.6 ITS-PCR electrophoretogram of some molds

2.4系統發育樹

由圖7可知，12、7、46、47、40、25、22、1、5、3、21、6、43、41、42、44、29、23、35、19、30、48、24、32、49、31、11、28號菌株的ITS序列與KF18428相近，屬于哈茨木霉，共28株菌株，這28株菌株雖都歸為哈茨木霉，但菌株間的ITS序列還是存在差異性，體現了香菇工廠化栽培料中木霉的多樣性。10、13、2、14、26、8、16、17、20、27、33、18號菌株的ITS序列與JX173846聚為一類，屬于側耳木霉，共12株菌株。39號和45號菌株的ITS序列與AB853782聚為一類，屬于深綠木霉。9、15、4號菌株的ITS序列與AY373897聚為一類，屬于短密青霉。34、37、36、38號菌株的ITS序列與JF723568相近，聚為一類，屬于總狀毛霉。

由基于ITS序列分析構建的系統發育樹可以看出，可以將分離出的菌株分為三大群。第一大群分為3組：第1組均為哈茨木霉，28個菌株。第2組為側耳木霉，12個菌株。第3組為深綠木霉，2個菌株。第一大群均為木霉。第二大群均為短密青霉，3個菌株，屬于青霉屬。第三大群均為總狀毛霉，4個菌株，屬于毛霉屬。這與形態學及BLAST同源性鑒定的結果一致。由遺傳距離可以看出，木霉和青霉的遺傳距離近，毛霉與木霉、青霉的遺傳距離遠。3個木霉種中，哈茨木霉與側耳木霉的遺傳距離較近。

圖7　由MEGA 5.10軟件構建的供試菌株系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of tested strains established by MEGA 5.10 software

2.5抑菌劑的篩選

2.5.1對霉菌與香菇菌絲的抑制作用比較

從表2可以看出，中生菌素對哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉菌絲生長抑制的EC50分別為：2.85 mg/L、1.00 mg/L、16.22 mg/L、43.65 mg/L，克霉靈對哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉菌絲生長抑制的EC50分別為：616.60 mg/L、467.74 mg/L、812.83 mg/L、416.87 mg/L，H2O2對哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉菌絲生長抑制的EC50分別為：1.87 mg/L、3.42 mg/L、2.15 mg/L、2.83 mg/L，短密青霉屬于局限性菌落，無法測量菌絲生長速度，故未對其進行菌絲抑制試驗。對比可知，H2O2和中生菌素相較于克霉靈，對5種霉菌的抑制作用更強。H2O2對哈茨木霉、深綠木霉、總狀毛霉菌絲生長的抑制作用優于中生菌素，但對側耳木霉的抑制作用不及中生菌素。從表中也可看出，3種抑菌劑對香菇菌絲生長也存在一定的抑制作用。

表2　抑菌劑對霉菌及香菇菌絲的抑制作用Table 2 Inhibiting effects of 3 fungistats on molds and L.edodes mycelia

2.5.2對孢子萌發的抑制作用比較

由表3可知，中生菌素抑制哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉和短密青霉孢子萌發的EC50分別為：3.80 mg/L、3.98 mg/L、3.31 mg/L、5.97 mg/L、4.07 mg/L，克霉靈抑制哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉、短密青霉孢子萌發的EC50分別為：151.36 mg/L、131.83 mg/L、138.04 mg/L、109.64 mg/L、69.18 mg/L，H2O2抑制哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉、短密青霉孢子萌發的EC50分別為：1.82 mg/L、0.80 mg/L、0.32 mg/L、1.54 mg/L、1.47 mg/L，對比可知，3種抑菌劑中對五種霉菌孢子萌發抑制作用最強的是H2O2，其次是中生菌素，抑制作用最弱的是克霉靈。

表3　抑菌劑對霉菌孢子萌發的抑制作用Table 3 Inhibiting effects of 3 fungistats on spore germination of 5 mold species

3　結論與討論

香菇工廠化壓塊栽培過程中，霉菌污染會發生在任何時期，當栽培瓶中菌絲發滿并經過一段后熟期的栽培料經重新壓塊后，最易受到雜菌污染。本研究首次針對香菇工廠化壓塊栽培中的污染霉菌進行研究，采集了經重新壓塊后受霉菌污染的香菇菌塊，分離純化出了49株霉菌，采用形態學鑒定和ITS鑒定，兩者的鑒定結果一致。形態學鑒定要求鑒定者有一定的鑒定經驗，會因為鑒定者的主觀因素而帶來誤差［17］，ITS鑒定相比形態學鑒定更為可靠，因此，本研究以ITS鑒定為主，對照形態學鑒定結果對49株霉菌進行了分類。鑒定結果表明，49株霉菌可分為3個屬：木霉、青霉、毛霉，5個種：哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、短密青霉、總狀毛霉，可以推斷這5種霉菌是香菇工廠化栽培料中的優勢污染真菌，其中木霉的分離頻率最高。在以往的研究中，吳小平［5］報道了哈茨木霉在食用菌栽培料中的分離頻率最高，覃培升等［7］研究發現側耳木霉和短密青霉都是平菇栽培料中的優勢污染種。霉菌常作為纖維素酶的生產菌株［18］，而香菇工廠化栽培料中含有大量的粗纖維和木質素，可以作為霉菌生長的良好基質，由此推測，這是霉菌成為香菇工廠化栽培中的主要污染真菌的原因。

此外，本研究對比了中生菌素、克霉靈、H2O23種抑菌劑的抑菌效果。本試驗中經檢測，添加H2O2時PDA的pH為5，溫度為50℃。H2O2在pH為3.5—4.5，溫度為40℃條件下性質最穩定，而pH為5，溫度50℃條件下雖有一定分解，但分解較少，性質較為穩定［19］，故H2O2在此條件下可以發揮抑菌作用。從抑菌劑對除短密青霉外的4種霉菌及香菇菌絲生長的抑制作用上看，H2O2和中生菌素抑制4種霉菌菌絲生長的EC50和EC90值遠小于克霉靈，即中生菌素對哈茨木霉、側耳木霉、深綠木霉、總狀毛霉菌絲生長的抑制效果強于克霉靈。由于短密青霉是局限性菌落，無法測量菌絲生長速度，故未對其進行菌絲抑制試驗。另外，由于霉菌的生長過程一般是從分生孢子或孢囊孢子開始，由孢子萌發逐漸形成菌絲，因此，抑制孢子的萌發也是防止香菇工廠化栽培中的有效措施。從對孢子萌發的抑制效果看，H2O2抑制五種霉菌的EC50和EC90值小于中生菌素和克霉靈，中生菌素抑制五種霉菌EC50和EC90值又遠小于克霉靈。因此，對五種霉菌孢子萌發的抑制效果由強到弱，依次為H2O2、中生菌素、克霉靈。張繼英等［1］報道證明了H2O2和克霉靈對總狀毛霉和綠色木霉的孢子萌發有較好的抑制作用，且H2O2的抑制效果優于克霉靈，這與本研究的結果基本一致。馬林等［20］等報道了中生菌素對木霉有很好的抑制作用，但中生菌素對青霉和毛霉的菌絲生長和孢子萌發的抑制作用尚屬首次報道。從安全性上對比，克霉靈是一種化學抑菌劑，藥劑用量不當會引起藥劑殘留從而危害食用者的健康。中生菌素是一種生物抑菌劑，不會產生農藥殘留［20］，在安全性上優于化學抑菌劑——克霉靈。H2O2作為一種無機物，加熱后可水解為無毒的H2O和O2，安全性最高。因此，綜合對比，H2O2最適合在香菇工廠化栽培中應用。

本研究只對比了3種抑菌劑對霉菌的抑制作用，對抑菌劑安全濃度的試驗尚未涉及，還有待進一步研究。另外，本研究結果僅是實驗室內的研究結果，其實際應用效果尚待生產檢驗。希望在以后的研究中通過使用適宜濃度的綠色高效抑菌劑，并配合調節溫度、pH等環境條件，降低香菇工廠化栽培中的霉菌污染，提高香菇產量。

參 考 文 獻

［1］張繼英，戚元成，王蘭青，等.幾種殺菌劑抑菌防雜比較試驗［J］.食用菌，2009（3）：68-70.

［2］SAVOIE J M，IAPICCO R，LARGETEAU-MAMOUN M L.Factors influencing the competitive saprophytic ability of Trichoderma harzianum Th2 in mushroom（Agaricus bisporus）compost［J］.Mycological Research，2001，105：1348-1356.

［3］萬魯長，宮志遠，張柏松，等.秸稈栽培食用菌霉菌污染綜合防控技術規范［J］.山東農業科學，2011（9）：108-109.

［4］馬燕芹，孫成洋.綠霉菌綜合防治技術［J］.農業知識，2014（8）：6-7.

［5］吳小平.食用菌致病木霉的鑒定、致病機理及防治研究［D］.福州：福建農林大學，2008.

［6］BEKADA A M A，BENAKRICHE B，HAMADI K，et al.Effects of water activity，pH and temperature on the growth rate of Mucor racemosus isolated from soft camembert cheese［J］.World Journal of Agricultural Sciences，2008，4（6）：790-794.

［7］覃培升，劉武，黎金鋒，等.平菇培養料青、綠霉菌的分離鑒定［J］.廣東農業科學，2013，40（4）：57-60.

［8］王剛正，曹現濤，邊銀丙.36種植物提取液對食用菌兩種競爭性木霉菌的抑制作用［J］.中國食用菌，2015（2）：6-7.

［9］PARK M S，BAE K S，YU S H.Molecular and morphplogical analysis of Trichoderma isolates associated with green mold epidemic of oyster mushroom in Korea［J］.Journal of Huazhong Agricultural.2004，23（1）：157-164.

［10］JOHANNA M，STEYAERTA，RICHARD J，et al.Ambient pH intrinsically influences Trichoderma conidiation and colony morphology［J］.Fungal Biology，2010，114：198-208.

［11］方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，1998：110-154.

［12］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，1979.

［13］楊合同.木霉分類與鑒定［M］.北京：中國大地出版社，2009.

［14］BISSETT J.A revision of the genusTrichoderma：Ⅱ-Ⅲ［J］.Can J Bot，1991，62：924-931.

［15］吳發紅，黃東益，黃小龍，等.幾種真菌DNA提取方法的比較［J］.中國農學通報，2009，25（8）：62-64.

［16］ZHANG Y.MOLINA F I.Strain typing of Lentinula edodes by random amplified polymorphic DNA assay［J］.FEMS Microbiol Lett，1995，131 （1）：17-20.

［17］覃培升.平菇培養料青、綠霉菌的分離鑒定及抗菌藥劑的篩選［D］.南寧：廣西大學，2012.

［18］吳小平，吳曉金，胡方平.食用菌栽培相關木霉種的鑒定［J］.農業生物技術學報，2008，16（6）：1048-1055.

［19］張清，應超燕，余可娜，等.雙氧水分解速率和穩定性研究［J］.嘉興學院學報.2010，22（3）：51-53.

［20］馬林，宋金俤，曲紹軒.六種生物殺菌劑對平菇及雜菌生長的影響［J］.食用菌，2010（3）：58-59.

（責任編輯：程智強）

Identification of common molds in factory cultivation of Lentinula edodes and screening of fungistats

ZHU Xiao-ling1，2，ZHANG Lu-jun1，ZHANG Jun-ling1，TAN Qi1，2，SHANG Xiao-dong1*
（1Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences/National Engineering Research Center of Edible Fungi，Shanghai 201403，China；2College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Abstract：In order to clarify dominant mold species in factory cultivation of Lentinus edodes，49 common molds were isolated and identified，and green and efficient fungistats were selected.Both morphological identification and ITS sequence analysis showed that the dominant mold species in the compost used for factory cultivation of L.edodes were Trichoderma harzinum，T.pleuroticola，T.atroviride，Penicillium brevicompactum and Mucor racemosus，and their isolation frequencies were 57%，25%，4%，6%and 8%respectively.The tests for 3 fungistats indicated that the descending order of inhibiting effects of fungistats on the hypha of the 4 mold species except P.brevicompactum was H2O2，Zhongshengmycin and Mepartricin，and that on the spore germination of all the 5 mold species was the same.H2O2had the highest safety in use and Zhongshengmycin took the second place.The above results could provide a scientific reference for mold pollution control in factory cultivation of L.edodes.

Key words：Lentinula edodes；Factory cultivation；Mold；Identification；Fungistat

中圖分類號：S436.46

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-083-08

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.17

收稿日期：2015-05-27

基金項目：國家科技支撐項目（2013BAD16B02）；現代農業產業技術體系建設專項（CARS-24）；上海種業專項［滬農科種字（2012）第6號］

作者簡介：朱曉玲（1991—），女，在讀碩士，研究方向：食用菌遺傳育種研究。E-mail：zxlangyo@126.com

*通信作者，E-mail：xdshang@163.com