甘草對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥骨形態(tài)計量學影響的研究

徐桃桃,劉仁斌,陳　峰,趙光恒,李成剛

(湖北省十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000)

甘草對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥骨形態(tài)計量學影響的研究

徐桃桃,劉仁斌,陳峰,趙光恒,李成剛

(湖北省十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的觀察甘草對去勢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型骨組織結(jié)構(gòu)的影響，探討其干預骨質(zhì)疏松的作用機制，為臨床研究提供實驗依據(jù)。方法建立去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型，將造模成功的45只雌性SD大鼠按隨機數(shù)字法分為去勢組、甘草湯低劑量組、甘草湯高劑量組，每組15只。去勢組給予生理鹽水灌胃，甘草湯低劑量組和甘草湯高劑量組分別給予甘草湯劑2 mL和4 mL灌胃，每周1次，連續(xù)16周。末次灌胃后24 h取大鼠脛骨組織，制作冰凍切片馮庫薩(von kossa)鈣染色觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用免疫組化和圖像分析技術(shù)測定骨小梁結(jié)構(gòu)的表達情況。結(jié)果去勢組僅骨小梁結(jié)構(gòu)少量表達；甘草湯低劑量組骨小梁組織表達相對增強，骨小梁數(shù)量增多、相對體積增大、分離度減小；甘草湯高劑量組骨小梁組織表達明顯增強，骨小梁數(shù)量、相對體積進一步增大而分離度顯著減小。甘草湯高、低劑量組骨小梁組織陽性目標總面積、骨小梁總周長及骨小梁數(shù)量均明顯高于去勢組(P均<0.05)，骨小梁分離度明顯低于去勢組 (P均<0.05)。結(jié)論甘草能夠增加成骨細胞中骨小梁的數(shù)量而保護骨組織，增加骨量,并能防止骨基質(zhì)的丟失,從而增加骨的韌性，可用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。

[關(guān)鍵詞]甘草；去勢大鼠；骨質(zhì)疏松癥；骨形態(tài)計量學

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨強度下降導致骨折危險性增加的骨骼疾病，嚴重危及中老年人的生活質(zhì)量，并成為危害公共健康問題之一[1]。女性在絕經(jīng)或絕經(jīng)后期骨丟失逐漸加速，繼而隨年齡增長發(fā)生骨礦物質(zhì)密度降低，骨的脆性增高，骨折危險性增加，更易于罹患此病[2]。雌激素缺乏是引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的公認因素，雌激素替代療法(ERT)是防治和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥以及預防骨折的首選方案[3]，但因長期使用雌激素類藥物有導致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的潛在危險，且存在價格昂貴等弊端，使患者難以長期堅持。因此，選用毒副作用小、標本兼治并可長期服用的中草藥治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為國內(nèi)醫(yī)學界的研究熱點。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展, 中藥療效的細胞、分子生物學機制逐漸被發(fā)現(xiàn)，為中藥治療的現(xiàn)代化和國際化創(chuàng)造了有利條件。甘草是一味應用極其廣泛的傳統(tǒng)中藥，其有效成分黃酮類、三萜類、多糖等化合物本身或經(jīng)過加工、修飾、改造，可以獲得高活性的抗骨質(zhì)疏松藥物。因此，本實驗通過手術(shù)切除成年雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法,模擬婦女絕經(jīng)狀態(tài),觀察不同劑量甘草提取液對去勢卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的骨形態(tài)計量學的影響，旨在為甘草防治骨質(zhì)疏松癥提供實驗依據(jù)。

1實驗資料

1.1實驗動物清潔級健康雌性SD大鼠45只，6月齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自湖北醫(yī)藥學院S動物實驗中心(SPF級)，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(鄂)2011-0008。實驗過程中，大鼠分籠于塑料籠內(nèi)飼養(yǎng)，每籠5只，籠蓋上用透氣通風的透明塑料遮擋，保持籠內(nèi)清潔，經(jīng)常清理籠內(nèi)異物。給予大鼠標準飼料，控制食量(20±1)g/d，自由飲水及活動。

1.2主要藥品、試劑與儀器設備甲基丙烯酸甲酯，沈陽市新化試劑廠生產(chǎn)；鄰苯二甲酸二丁酯、過氧化苯甲酰，北京永定化工廠生產(chǎn)；3%戊巴比妥鈉，上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠,批號：950427；堿性磷酸酶檢測試劑盒，廣州標佳科技有限公司，批號：2400083；冰凍切片馮庫薩(von kossa)鈣染色試劑盒，上海杰美醫(yī)藥科技有限公司，批號：GMS80045.2；全自動生化分析儀：日立71-800； NIKON YX2-H 顯微鏡；切片石蠟機(上海標本模具廠，Q/YSQN.40.91)；NIKON Spot 圖像采集系統(tǒng)(湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院提供)；Image-pro plus 軟件；Jung K骨切片機；物理天平、烘箱、量筒、包埋用小玻璃瓶若干等。

1.3動物造模及分組在無菌條件下，取大鼠下腹正中切口，切除雙側(cè)卵巢，結(jié)扎輸卵管及伴行的血管，縫合切口，術(shù)時均予3%戊巴比妥鈉溶液按0.1 mL/100 g腹腔麻醉。術(shù)后將實驗動物隨機分為去勢組、甘草湯低劑量組、甘草湯高劑量組，每組15只。

1.4藥物制備與給藥方法取甘草100 g加水500 mL,煎煮濃縮至50 mL，分裝到2 mL的一次性試管中，4 ℃保存。術(shù)后第2周傷口愈合后，去勢組給予生理鹽水2 mL/只灌胃，甘草湯低劑量組給予甘草湯劑2 mL/只灌胃，甘草湯高劑量組給予甘草湯劑4 mL/只灌胃，均每周1次，一直持續(xù)到第17周。

1.5實驗樣本的獲取末次灌胃后24 h內(nèi)以腹主動脈放血法處死大鼠，迅速取雙側(cè)脛骨仔細剝離附著肌肉、結(jié)締組織。脛骨用生理鹽水沖洗，放入4%甲醛溶液中固定24 h以上，10%福爾馬林溶液固定 5～7 d， 流水沖洗，用70%，80%，90%，95% 和 100% 乙醇進行逐級脫水并透二甲苯透明24 h，常規(guī)石蠟包埋，von kossa 染色(不顯示鈣質(zhì))，制作病理學切片，片厚5 μm，光學顯微鏡觀察骨小梁的變化并攝像，其中骨小梁為棕黑色，其他為黃色。

1.6骨組織形態(tài)計量學測量骨組織形態(tài)計量學的動態(tài)和靜態(tài)參數(shù)在脛骨近端干骺端生長板下1～5 mm范圍內(nèi)的次級松質(zhì)骨(Secondary Spongiosa)中測量，每只大鼠隨機選3張切片，每張切片以單盲法在次級松質(zhì)骨范圍內(nèi)隨機選取3個視野，以細胞質(zhì)清晰棕黑為陽性。采用圖像分析軟件Image-Pro plus 6.0，根據(jù)文獻[4]方法標準對骨小梁陽性部位進行原位定量檢測，每張切片隨機選用3個視野(10×40)，自動選取陽性部位并計算相對IOD 值，并將骨組織切片在顯微鏡下放大200倍，每組隨機選取直徑完整的脛骨縱截面30個，測定骨組織面積(T.Ar)、骨小梁面積(Tb.Ar)、骨小梁周長(Tb.Pm)，采用公式計算骨小梁分離度(Tb.Sp)：2 000/1.199×(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm，骨小梁數(shù)量(Tb.N)：1.199/2 ×Tb.pm/T.Ar，骨小梁厚度(Tb.Th):2 000/1.199× Tb.Ar/Tb.Pm，進行圖像數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計。

2結(jié)果

2.1各組脛骨組織病理學表現(xiàn)去勢組僅骨小梁結(jié)構(gòu)少量表達；甘草湯低劑量組骨小梁組織表達相對增強，骨小梁數(shù)量增多、相對體積增大、分離度減??；甘草湯高劑量組骨小梁組織表達明顯增強，骨小梁數(shù)量、相對體積進一步增大而分離度顯著減小。見圖1～3。

圖1　去勢組脛骨組織病理學表現(xiàn)(von kossa染色，×100)

圖2　甘草湯低劑量組脛骨組織病理學表現(xiàn)(von kossa染色，×100)

圖3　甘草湯高劑量組脛骨組織病理學表現(xiàn)(von kossa染色，×100)

2.2各組脛骨組織形態(tài)計量學結(jié)果甘草湯高、低劑量組骨小梁組織陽性目標總面積、骨小梁總周長及骨小梁數(shù)量均明顯高于去勢組(P均<0.05)，骨小梁分離度明顯低于去勢組(P均<0.05) 。見表1。

表1　各組脛骨組織形態(tài)計量學結(jié)果±s )

注：①與去勢組比較，P<0.05。

3討論

關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的病因，尚不夠完全明確，傳統(tǒng)觀點證實，骨質(zhì)疏松癥主要與內(nèi)分泌代謝紊亂、機械性力學、骨的老化、年齡、遺傳等因素有關(guān)。然而，最近國外研究提出了骨免疫學的觀點，認為在骨質(zhì)疏松發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)和免疫因素起了重要的調(diào)節(jié)作用，即骨髓中免疫系統(tǒng)的發(fā)育，依賴于骨細胞營造的微環(huán)境，并且骨組織在獲得性免疫中也會發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，同時免疫系統(tǒng)可通過淋巴細胞、樹突細胞、細胞因子等調(diào)控骨代謝[5]。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生和發(fā)展可能是由于骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力及增殖能力的下降而造成的，即正常骨髓間充質(zhì)干細胞能夠向成骨、成軟骨等不同細胞系分化并保持平衡，當骨髓間充質(zhì)干細胞的分化能力改變時可能會導致疾病的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)植物中的某些成分可以作為一些免疫調(diào)節(jié)因子，降低破骨細胞活性，提高成骨細胞的建造能力，增加骨小梁的數(shù)量，從而為治療骨質(zhì)疏松開辟了新的方向。中藥甘草已被分離出多種黃酮類化合物、三萜類化合物以及香豆素類、多種氨基酸、生物堿、雌性激素和多種有機酸等物質(zhì)，已被證實有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗炎、降壓降脂、美白等功效。有文獻報道甘草酸單銨鹽對大鼠的炎性因子TNF-α及前列腺素具有明顯的抑制作用，可降低關(guān)節(jié)液中TNF-α的生成來抑制炎癥的反應，防止破骨細胞生成，從而減少骨浸蝕和骨破壞，降低骨質(zhì)疏松的發(fā)病率[7-8]。Simmler等[9]認為甘草黃酮的生物活性主要來自于下調(diào)細胞內(nèi)活性氧的能力，結(jié)合抗氧化效應，并作用于雌激素受體，可能作為一種選擇性的植物雌激素受體調(diào)節(jié)劑來防止骨的破壞。Choi[10]研究表明，甘草黃酮可降低因線粒體功能障礙引起的老化，并能防止骨質(zhì)疏松患者的成骨細胞的損傷，這可能與甘草黃酮誘導、激活的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)細胞保護反應通路有關(guān)。Zhu等[11]也證實異甘草素(ISL)能夠抑制核因子-受體激動劑配體(RANKL)誘導的通過RANK-TRAF6、MAPK、 AP-通路介導的破骨細胞形成和炎癥性的骨損失。這些研究均表明甘草可防止骨破壞，可能是由于甘草通過影響了骨的生長、代謝免疫因子調(diào)節(jié)機制而起作用的。

骨組織形態(tài)計量學是70年代發(fā)展的，通過不脫鈣骨的切片在顯微鏡下對骨組織進行定量分析的一種方法[12]。它是在二維的骨組織切片圖像上，利用體視學方法，推導出反映骨重建、骨結(jié)構(gòu)的三維參數(shù)，骨小梁間距、骨小梁厚度、體密度、皮質(zhì)骨厚、面密度、骨小梁的彌散度等，并且能夠分析類骨質(zhì)，計算類骨質(zhì)體積、平均骨壁厚等指標，獲取骨細胞水平上的信息。骨組織形態(tài)計量學是一種直接研究骨組織本身，觀察骨內(nèi)變化的組織定量分析方法，對于骨的顯微結(jié)構(gòu)，尤其對骨小梁網(wǎng)狀系統(tǒng)、骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)、骨表面、骨間質(zhì)和骨轉(zhuǎn)換均可進行精確描述，有助于揭示骨的生理與病理改變的功能。功能的改變會影響形態(tài)學結(jié)構(gòu)，所以從骨組織面積、骨小梁面積、骨小梁周長、骨小梁分離度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度等形態(tài)計量學指標進行研究具有重要的意義。

本實驗研究結(jié)果顯示，去勢組僅骨小梁結(jié)構(gòu)少量表達；甘草湯低劑量組骨小梁組織表達相對增強，骨小梁數(shù)量增多、相對體積增大、分離度減小；甘草湯高劑量組骨小梁組織表達明顯增強，骨小梁數(shù)量、相對體積進一步增大而分離度顯著減小。甘草湯高、低劑量組骨小梁組織陽性目標總面積、骨小梁總周長及骨小梁數(shù)量均明顯高于去勢組，骨小梁分離度明顯低于去勢組。提示甘草湯可以通過增加成骨細胞中骨小梁的數(shù)量保護骨組織，增加骨量,并能防止骨基質(zhì)的丟失,從而增加骨的韌性，可用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。但是，甘草湯具體通過何種機制和途徑作用于骨細胞重建來達到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，尚有待于進一步研究，這也是本課題組下一步的研究目標與方向。

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Experimental study of glycyrrhiza on the bone histomorphometry in ovariectomized osteoporotic rats

XU Taotao，LIU Renbin, CHEN Feng, ZHAO Guangheng, LI Chenggang

(Shiyan People's Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of glycyrrhiza on the bone histomorphometry in ovariectomized osteoporotic rats, and explore the intervention mechanism of osteoporosis, so as to provide experimental basis for clinical research. Methods The ovariectomized rat models of osteoporosis were established, 45 SD female rats were randomly divided into 3 groups, ovariectomized control group (A), short dose of glycyrrhiza group (B), high dose of glycyrrhiza group (C), 15 rats in each group. By corresponding method of intervention, the hismorphological structure of bone tissue sections were observed after staining by von kossa calcium staining, and the bone trabecula expression was detected by immunohistochemistry and image analysis technique. Results There was a little expression of trabecular bone structure in the ovariectomized control group (A);and the expression of the trabecular bone tissue, trabecula bone number, relative volume were increased,the degree of separation decreased in the short dose of glycyrrhiza group (B);and the expression of the trabecular bone tissue, trabecula bone number, relative volume were further increased and the degree of separation significantly decreased in high dose of glycyrrhiza group (C). Compared with the ovariectomized control group (A)，the trabecular bone area, trabecular bone perimeter, trabecular bone number, trabecular bone degree of separation all have a statistically significant difference(P<0.05 ). Conclusion Glycyrrhiza can protect bone tissue through raise bone cells and the bone trabecular number，prevent the loss of bone matrix, increasing the toughness of bone. Consequently glycyrrhiza has an distinct curative effect on osteoporosis.

Key words:glycyrrhiza; ovariectomized rats; osteoporosis; bone histomorphometry

[作者簡介]徐桃桃，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事骨科疾病及神經(jīng)康復的科研及臨床工作。 [通信作者]李成剛，E-mail：thxuefeng@126.com

[基金項目]湖北醫(yī)藥學院院級課題(B20112012)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.006

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)10-1044-04

[收稿日期]2015-10-20