建立頭孢泊肟酯干混懸劑微生物限度檢查方法

劉曉菲

摘 要：單一采用培養(yǎng)基稀釋法或中和法不適用于頭孢泊肟酯干混懸劑微生物限度日常檢驗(yàn)檢查，通過試驗(yàn)，研究結(jié)合運(yùn)用兩個(gè)方法進(jìn)行微生物限度檢查。對建立的結(jié)合方法進(jìn)行效果確認(rèn)，能夠達(dá)到中國藥典要求，適用于頭孢泊肟酯干混懸劑微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞：頭孢泊肟酯干混懸劑；微生物限度檢查；頭孢菌素酶

中圖分類號： TQ46 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1673-1069（2016）16-177-2

0 引言

頭孢泊肟酯干混懸劑主要成分為頭孢泊肟酯，是口服廣譜第三代頭孢菌素[1]，具有很強(qiáng)的殺菌作用。中國GMP要求制藥企業(yè)對非無菌藥品進(jìn)行微生物限度檢查[2]。頭孢類抗生素制劑的微生物限度檢查方法一般采用薄膜過濾法，但是頭孢泊肟酯干混懸劑抑菌性強(qiáng)[3]，過濾時(shí)間長，不適用于薄膜過濾法，因此，建立一種高效簡便的微生物檢查方法勢在必行。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸埃希菌（ATCC8739）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲霉（ATCC16404）、銅綠假單胞菌（ATCC9027），菌種均購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 中和劑

頭孢菌素酶（批號：20160104 廠家：杭州北望生物技術(shù)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 需氧菌總數(shù)檢查試驗(yàn)

取10g供試液加入100mL0.9%無菌氯化鈉溶液中，制備成1：10的供試液。取在空的無菌培養(yǎng)基平皿中加入0.1 mL供試液，分別加入1mL金黃色葡萄球菌菌液、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌菌液（<100CFU/ mL），在每個(gè)平皿中加入10萬單位頭孢菌素酶，然后注入20mL 45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每種試驗(yàn)菌平行做2個(gè)平板，輕輕搖勻，待培養(yǎng)凝固后，置于30～35℃培養(yǎng)3天后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率[4]。

同法測定加入30萬單位和50萬單位頭孢菌素酶的回收率。

1.4.2 霉菌及酵母菌總數(shù)檢查試驗(yàn)

取1：10供試液1ml加入空的無菌培養(yǎng)基平皿中，分別加入1mL白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液（<100CFU/ mL），在每個(gè)平皿中加入1千單位頭孢菌素酶，然后注入20mL 45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每種試驗(yàn)菌平行做2個(gè)平板，輕輕搖勻，待培養(yǎng)凝固后，置于20～25℃培養(yǎng)5天后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率[4]。

同法測定加入1萬單位和10萬單位頭孢菌素酶的回收率。

1.4.3 控制菌檢查試驗(yàn)

取1：10供試液10ml分加到5瓶500ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中每瓶2ml，加入1mL大腸埃希菌菌液（<100CFU/ mL），再加入10萬單位的頭孢菌素酶，于30～35℃下培養(yǎng)18小時(shí) ，吸取上述預(yù)培養(yǎng)物到麥康凱液體培養(yǎng)基， 42～44℃培養(yǎng) 18小時(shí)，取培養(yǎng)液劃線接種于麥康凱瓊脂平板上 ，30～35℃下培養(yǎng)18小時(shí)后，若有菌生長，則對菌落進(jìn)行分離和鑒定，判斷是否為大腸埃希菌[5]。

同法測定加入30萬單位和50萬單位頭孢菌素酶的回收率。

1.4.4 結(jié)合法的效果確認(rèn)試驗(yàn)

選取3批頭孢泊肟酯干混懸劑，按照以上3個(gè)試驗(yàn)確定的檢驗(yàn)方法，用5種細(xì)菌測試需氧菌總數(shù)回收率，用2種真菌測試霉菌及酵母菌總數(shù)回收率，觀察控制菌的檢查結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 加入不同量中和劑的需氧菌總數(shù)檢查試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，得出加入30萬單位和50萬單位頭孢菌素酶后，各試驗(yàn)菌的回收率達(dá)到50%以上，符合中國藥典要求。考慮到日常檢驗(yàn)中的人員操作誤差，為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，加酶量選擇50萬單位。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，得出加入1萬單位、10萬單位頭孢菌素酶后，各試驗(yàn)菌的回收率達(dá)到50%以上，符合中國藥典要求。考慮到日常檢驗(yàn)中的人員操作誤差，為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，加酶量選擇10萬單位。

通過試驗(yàn)，得出加入10 萬單位頭孢菌素酶不能檢出控制菌，加入30萬單位50萬單位頭孢菌素酶后，均可檢出控制菌，為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，加酶量選擇50萬單位。

2.4 結(jié)合法的效果確認(rèn)

3 結(jié)論

經(jīng)過研究，將培養(yǎng)基稀釋法和中和法相結(jié)合，建立了頭孢泊肟酯干混懸劑微生物限度檢查方法。

需氧菌總數(shù)檢查方法：取10g供試液加入100mL0.9%無菌氯化鈉溶液中，制備成1：10的供試液。取1：10供試液0.1 mL加入無菌培養(yǎng)基平皿中，加入50萬單位頭孢菌素酶，然后注入20mL 45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平板，輕輕搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，置于30～35℃培養(yǎng)3天后，菌落計(jì)數(shù)。

霉菌及酵母菌總數(shù)檢查方法：取1：10供試液1mL加入無菌培養(yǎng)基平皿中，加入10萬單位頭孢菌素酶，然后注入20mL 45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平板，輕輕搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，置于20～25℃培養(yǎng)5天后，菌落計(jì)數(shù)。

控制菌檢查方法：取1：10供試液10ml分加到5瓶500ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中每瓶2ml，加入50萬單位的頭孢菌素酶，30～35℃下培養(yǎng)18小時(shí) ，吸取上述預(yù)培養(yǎng)物到麥康凱液體培養(yǎng)基， 42～44℃培養(yǎng) 18小時(shí)。取培養(yǎng)液劃線接種于麥康凱瓊脂平板上 ，30～35℃下培養(yǎng)18小時(shí)后，觀察菌落。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 孟現(xiàn)民，董平，姜旻，張永信.頭孢菌素類抗菌藥物的開發(fā)歷程與研究近況[J].上海醫(yī)藥，2011，32（5）：218-221.

[2] 國家藥品監(jiān)督管理局.藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[M].北京.2010：6-7.

[3] 于威，金海波.關(guān)于頭孢菌素類藥物的綜述[J].醫(yī)藥與保健，2010（05）：210.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2015年版.四部.中國醫(yī)藥科技出版社，2015.6：140-144.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2015年版.四部.中國醫(yī)藥科技出版社.2015.6：145-147.