急性痛風性關節炎患者治療前后外周血單核細胞NLRP3炎性體mRNA表達及血清TNF-α水平的研究

丁煥發* 徐曉辰王尚云劉淑娟蘭立強韋涌濤（ 青島市第八人民醫院內分泌科，山東 青島 6600； 青島市第八人民醫院檢驗科，山東 青島 6600）

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急性痛風性關節炎患者治療前后外周血單核細胞NLRP3炎性體mRNA表達及血清TNF-α水平的研究

丁煥發1* 徐曉辰1王尚云2劉淑娟1蘭立強1韋涌濤2
（1 青島市第八人民醫院內分泌科，山東 青島 266100；2 青島市第八人民醫院檢驗科，山東 青島 266100）

【摘要】目的 檢測急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis，AGA）患者治療前后外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）中NLRP3炎性體［NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）］mRNA表達水平及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α水平的變化，探討該炎性體及TNF-α在AGA發病中可能的作用機制。方法 用RT-PCR法檢測100名健康查體者（對照組，C）和100例AGA患者（觀察組，T）治療前（D0）及應用藥物治療后第3天（D3）、第7天（D7）、第14（D14）天NLRP3炎性體mRNA表達水平，同時用ELISA法測定相應TNF-α水平。觀察組與對照組比較采用獨立樣本t檢驗，一般生理指標及血生化指標用獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。計量資料用（?±s）表示。采用IBM SPSS 19.0軟件包對所有數據進行統計學分析。結果 觀察組NLRP3 mRNA表達水平D0、D3及D7vs C顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），D14 vs C差異無統計學意義（P＞0.05）；觀察組各階段ASC mRNA表達水平與對照組相比顯著升高，差異均有統計學意義，其中D0、D3及D7 vs C（P＜0.01）、D14 vs C（P＜0.05）；觀察組caspase-1 mRNA表達水平，D0及D3 vs C顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），D7及D14 vs C差異無統計學意義（P＞0.05）。觀察組D0、D3、D7血清TNF-α水平與對照組相比顯著升高，差異有統計學意義（均為P＜0.01）。D14與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 NLRP3炎性體及TNF-α在AGA患者治療過程中水平異常，提示它們在AGA發病中參與了炎性反應過程，在炎癥機制中可能發揮了重要作用。

【關鍵詞】凋亡相關斑點樣蛋白；半胱天冬酶-1；NLRP3；炎性體；痛風性關節炎

隨著社會的發展，人們的生活水平、飲食結構及社交行為方式發生了很大的改變，同時人類壽命也在延長，痛風的患病率逐年上升，AGA患病率隨年齡的增長有逐漸增高的趨勢，且常伴有糖尿病、肥胖、心腦血管病、腎臟病等，發病高峰年齡為40歲左右，臨床上以男性患者多見，女性約占5%［1］，且多為絕經期后婦女。近年來研究發現單核/巨噬細胞系統在急性痛風性關節炎啟動、進展及緩解中均發揮了關鍵作用，其中IL-1β是單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）晶體誘導炎癥的關鍵因子，NLRP3炎性體通過促進IL-1β的生成在AGA發作中發揮不可替代的作用［2］，其介導的炎性因子的活化不僅涉及IL-1β，還包括TNF-α。在AGA患者，TNF-α來源于單核細胞、巨噬細胞及襯里細胞，在炎性反應中發揮細胞活化、內皮細胞黏附、吞噬作用。本研究即對此進行研究、探討，以期發現NLRP3炎性體及TNF-α 在AGA啟動、進展及緩解的各個階段的表達水平及意義，指導AGA的早期防治及優化治療方案。

1 對象與方法

1.1 研究對象。觀察組（T）：隨機選取符合以下診斷標準和剔除標準的患者100例（男95例，女5例），年齡（47.25±10.99）歲，全部來自本院2014年8月至2016年2月的門診患者。①急性痛風性關節炎診斷標準：應用美國風濕病協會（ACR）1997年制定的診斷標準。②入選和剔除標準：a.符合ACR診斷標準的急性原發性痛風性關節炎。b.排除心血管、腎臟、血液疾病、腫瘤疾病引起的繼發性痛風。c.排除合并感染性疾病患者。d.排除自身免疫性疾病及全身系統疾病患者。e.年齡18～75歲。f.一般情況良好。g.未服用降尿酸藥物治療者。對照組（C）：隨機選取青島本地居民健康查體者100例（男95例，女5例），年齡（46.15±11.80）歲，排除高尿酸血癥患者。高尿酸血癥的診斷標準：是指正常嘌呤飲食狀態下，非同日2次空腹血清尿酸水平（37 ℃）男性＞420 μmol/L，絕經前女性＞360 μmol/L，絕經后女性的診斷標準同男性。

表2 兩組NLRP3 mRNA表達水平（±s）

表2 兩組NLRP3 mRNA表達水平（±s）

注：*觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.01，#觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.05

NLRP3炎性體mRNA 觀察組（T）對照組（C）D0　D3　D7　D14 ASC mRNA　0.028±0.016*　0.030±0.020*　0.017±0.012*　0.013±0.007#　0.011±0.006 csapase -1 mRNA　0.047±0.030*　0.052±0.030*　0.113±0.057　0.124±0.066　0.119±0.061 NLRP3 mRNA　0.077±0.039*　0.086±0.046*　0.103±0.054*　0.123±0.078　0.130±0.070

表3 兩組TNF-α水平比較（±s）

表3 兩組TNF-α水平比較（±s）

注：*觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.01，#觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.05

觀察組（T）對照組（C）D0　D3　D7　D14 TNF-α（ng/mL）　532.77±217.95*　554.28±206.00*　421.11±143.34*　225.51±49.91#　216.57±43.76炎性因子

1.2 治療方案：在低嘌呤飲食、足量飲水前提下，AGA藥物治療方案：①鎮痛：為主要治療措施。秋水仙堿片，服藥療程14 d：前3 d 0.5毫克/次，3次/天，餐后服；然后0.5毫克/次，2次/天，餐后服，連續用藥7 d；后4 d 0.5毫克/次，1次/晚，睡前服。依托考昔片，服藥療程10 d：前3 d 120毫克/次，1次/天，餐后服；3 d后60毫克/次，1次/天，餐后服，連續用藥7 d。②堿化尿液：抑制尿酸在腎臟形成晶體，促進尿酸腎臟排泄。尿pH值維持在6.2～6.8。給予口服枸櫞酸鉀鈉顆粒（逍適檸）2.5克/次，4次/天（三餐后及睡前）。治療過程中若出現肝、腎功能異常及胃腸道反應則予以排除。

1.3 觀測指標：①測定兩組的一般生理指標：年齡（Age）、身高（BH）、體質量（BW）、收縮壓/舒張壓（SBP/DBP）、腰圍（WC）、臀圍（HC）。計算腰臀比（WHR）及體質量指數（BMI）。BMI=體質量（kg）/身高（m）2。②測定兩組的空腹血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、C-反應蛋白（CRP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）。測定兩組全血白細胞總數（WBC）、中性粒細胞數（NEUT）、中性粒細胞百分比（NEUT%）。③測定觀察組治療前（第0天，D0）及治療后第3天（D3）、第7天（D7）、第14天（D14）PBMCs中NLRP3 mRNA、ASC mRNA及 caspase-1 mRNA。測定相應時間點的空腹血清TNF-α水平。同時測定對照組上述指標，與觀察組治療前指標進行比較研究。

1.4 主要檢測方法：所有入選者由專人進行一般生理指標測量并記錄。實驗中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、 Cr、BUN的檢測用全自動生化分析儀，TNF-α的檢測采用ELISA試劑盒。PBMCs中NLRP3、ASC及 caspase-1 mRNA采用RT-PCR檢測。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自動血液分析儀檢測。

1.5 統計學處理：觀察組與對照組NLRP3炎性體mRNA比較采用獨立樣本t檢驗，一般生理指標、血生化指標及全血分析白細胞數等用獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。計量資料用（±s）表示。采用IBM SPSS 19.0軟件包對所有數據進行統計學分析，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結 果

2.1 一般臨床資料及實驗室檢查指標比較：觀察組與對照組比較，兩組性別、Age、AST差異均無統計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，觀察組BH、BW、BMI、SBP、DBP 、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C、C-RP、WBC、NEUT、NEUT%均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05～0.01），見表1。

表1 兩組一般資料及實驗室檢查指標水平（±s）

表1 兩組一般資料及實驗室檢查指標水平（±s）

注：*觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.01，#觀察組與對照組相比（T vs C）P＜0.05

項目　　組別觀察組（T）　　對照組（C）性別（Sex，Male/Female）　95/5　95/5年齡（Age，Year）　47.25±10.99　46.15±11.80身高（BH，cm）　171.97±5.61*　162.82±6.34體質量（BW，kg）　79.76±11.01*　65.08±9.71體質量指數（BMI，kg/m2）　26.87±3.54*　24.48±2.87收縮壓（SBP，mm Hg）　138.96±14.90*132.61±16.74舒張壓（DBP，mm Hg）　88.24±11.22*　83.65±8.95腰圍（WC，cm）　96.77±8.29*　87.10±8.90臀圍（HC，cm）　104.74±6.56*　101.11±7.65腰臀比（WHR）　0.92±0.05*　0.86±0.05空腹血糖（FPG，mmol/L）　6.48±1.49*　5.99±0.98尿酸（UA，μmol/L）　432.21±127.56*275.93±69.47丙氨酸轉氨酶（ALT，U/L）　29.40±19.37*　20.05±13.18天冬氨酸轉氨酶（AST，U/L）　20.72±9.62　19.79±7.27血肌酐（Cr，μmol/L）　83.37±28.59*　61.78±13.35尿素氮（BUN，mmol/L）　5.97±2.36*　4.50±0.87三酰甘油（TG，mmol/L）　2.56±2.19*　1.46±0.85總膽固醇（TC，mmol/L）　5.91±1.35*　5.21±1.17低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C，mmol/L）　3.72±0.97*　3.06±0.96高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，mmol/L） 1.31±0.21*　1.45±0.28 C-反應蛋白（CRP，mg/L）　7.36±3.66*　3.55±0.84白細胞總數（WBC，×109/L）　8.80±1.45*　6.24±1.01中性粒細胞（NEUT，×109/L）　7.40±1.57*　4.41±0.93中性粒細胞百分比（NEUT%）　0.84±0.10*　0.70±0.07

2.2 兩組NLRP3 mRNA表達水平比較：觀察組NLRP3 mRNA表達水平D0、D3及D7vs C顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），D14 vs C差異無統計學意義（P＞0.05）；觀察組各階段ASC mRNA表達水平與對照組相比顯著升高，差異均有統計學意義，其中D0、D3及D7 vs C（P＜0.01）、D14 vs C（P＜0.05）；觀察組caspase-1 mRNA表達水平，D0及D3vs C顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），D7及D14 vs C差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 兩組TNF-α水平比較：觀察組D0、D3、D7血清TNF-α水平與對照組相比顯著升高，差異有統計學意義（均為P＜0.01）。D14與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討 論

痛風（Gout）是因嘌呤代謝障礙和（或）尿酸排泄減少、血UA持續升高而導致MSU 晶體析出并沉積于組織或器官引起的一組臨床癥候群，屬于代謝性風濕?。?］。報道顯示，國內痛風的患病率目前在1%～3%，2009年山東沿海地區當地居民痛風患病率為1.96%，2007年～2008年美國痛風患病率上升至3.9%［4］。AGA可發生于任何年齡，發病高峰年齡為40歲左右，且常伴有糖尿病、肥胖、心腦血管病、腎臟病等，患病率隨年齡的增長有逐漸增高的趨勢。本研究中，與對照組相比，觀察組BH、BW、BMI、SBP、DBP 、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C均明顯升高（P＜0.01）亦支持上述觀點。AGA臨床上以男性患者多見，女性約占5%［1］，且多為絕經期后婦女。AGA發作時疼痛劇烈，患者異常痛苦，嚴重影響日常工作和生活。近年來研究發現單核/巨噬細胞系統在AGA啟動、進展及緩解中均發揮了關鍵作用，發作涉及IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等多種炎性因子，其中IL-1β是MSU晶體誘導炎癥的關鍵因子，TNF-α作為一個重要的炎性因子，在AGA時大量釋放到循環中，刺激全身的急性時相反應，可致全身不適、發熱、WBC升高。

NLRP3炎性體，即Nod樣受體蛋白3 （Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體是位于細胞內的一種蛋白質復合體，主要功能為活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）以間接調控IL- lβ、IL-18［5］、和IL-33等的成熟和分泌，具有調控機體炎性反應的功能。NLRP3炎性體是由核苷酸結合寡聚化結構域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）家族成員NLRP3 （NLR family，pyrin domain containing 3）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1）組成的復合體，是內源性或外源性危險信號的胞質內感受器，是活化caspase-1的分子平臺，調控IL-lβ和IL-18等促炎細胞因子的成熟和分泌。IL-lβ是一個經典的促炎性細胞因子，活化的IL-lβ與靶細胞上的IL-1受體結合，激活IL-1信號通路和髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MyD88）依賴的NF-κB通路，促進IL-1等促炎因子轉錄，誘導機體炎性反應。研究證實，IL-lβ是促進多種代謝性疾病發生發展的重要炎性因子，阻斷其生物學效應能有效緩解代謝性疾病的進展。NLRP3是模式識別胞內受體Nod樣受體蛋白家族的成員，廣泛表達于樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞，具有識別病原體的功能。ASC是NLRP3炎性體的雙重銜接蛋白，能夠以某種橋梁的形式將NLRP3和caspase-1前體連接起來，最終形成具有酶活性的異二聚體caspase-1。caspase-1作為炎性體的效應蛋白，能夠將無活性的IL-18和IL-1β前體剪切為成熟的IL-18和IL-1β，促進其成熟分泌。

目前研究認為，NLRP3炎性體是MSU 導致痛風的核心機制。Martinon等［6］研究顯示，NLRP3介導MSU誘導痛風發生發展，其機制可能與MSU誘導K+外流有關，還可能與線粒體來源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）釋放有關，溶酶體破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小體的機制之一。本研究結果顯示，AGA發病時及治療后第3天，NLRP3 mRNA、ASC mRNA及caspase-1 mRNA表達水平均顯著高于對照組（P＜0.01），說明在炎癥早期，NLRP3炎性體參與了疾病過程。治療后第7天，患者NLRP3 mRNA、ASC mRNA表達水平仍高于對照組（P＜0.01），caspase-1 mRNA表達水平與對照組無明顯差異，提示在炎癥持續存在期間，NLRP3炎性體持續參與炎癥過程，隨病程進行，炎癥消退過程中，抑制炎癥的調控因素可能逐漸出現。治療第14天NLRP3 mRNA及caspase-1 mRNA表達水平與對照組無明顯差異，ASC mRNA表達水平仍高于對照組（P＜0.05），較前已明顯降低，結果顯示AGA炎癥消退，趨于正常，ASC表達可能存在其他途徑及意義。

AGA的前炎性介質來源于常駐的滑膜細胞和遷移的單核巨噬細胞，而NEUT的侵入和活化是最重要的環節。發病時關節滑液和滑膜中出現的大量NEUT甚至可與急性化膿性關節炎時相當［7］。本研究中，發病時的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均顯著高于對照組，提示AGA發病時WBC及NEUT在炎癥初期就參與了反應。

TNF-α是一種具有內毒素樣抗腫瘤炎性細胞因子，可作用于T細胞、B細胞、NK細胞發揮多種生物學活性。TNF-α主要由巨噬細胞、單核細胞產生，中性粒細胞、內皮細胞、星狀細胞、平滑肌細胞、殺傷細胞也可產生TNF-α。有研究表明［8］，TNF-α在風濕性關節炎的血清和滑膜中大量增加，并刺激下丘腦體溫調節中樞及巨噬細胞釋放IL-1、IL- 6。TNF-α主要作用是刺激機體產生炎性反應，減低基質中蛋白多糖、膠原物質的合成，誘導基質金屬蛋白酶高表達，增加血管內皮細胞的通透性，刺激產生如IL-1、IL-6、IL-8 等炎性細胞因子。研究顯示，在炎癥的早中期階段，痛風患者關節液中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平和白細胞水平明顯升高。本研究中，觀察組D0、D3、D7血清TNF-α水平與對照組相比顯著升高，差異有統計學意義（均為P＜0.01）。D14與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），表明在AGA炎癥啟動及進展階段TNF-α水平升高，在炎癥緩解階段TNF-α水平逐漸降低，與國內有些研究結果相一致［9-10］。TNF-α可加速急性滑膜炎關節滑液內的NEUT凋亡過程，凋亡的NEUT可被巨噬細胞所吞噬［7］。關于TNF-α對NEUT凋亡影響的研究結論尚不一致。

總之，本研究結果表明，NLRP3炎性體及TNF-α在AGA患者發病及治療過程中水平異常，提示它們在AGA發病中參與了炎性反應過程，在炎癥機制中可能發揮了重要作用。結果亦提示，NLRP3炎性體及TNF-α在炎癥過程存在與多種炎性因子的共同作用，相互影響，亦存在相關負向調節，它們在炎癥發生、進展及緩解中的負面作用亦可能存在，需要在今后的研究中進一步探討。

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中圖分類號：R589.7

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8194（2016）15-0001-03

基金項目：青島市衛生科技發展計劃項目，項目編號：2014-WJZD103

*通訊作者：E-mail：huanfadings@163.com

Expression of NLRP3 Inflammasome mRNA in PBMCs and Serum Level of TNF-α of Patients with Acute Gouty Arthritis in the Course of Disease Process

DING Huan-fa1， XU Xiao-chen1， WANG Shang-yun2， LIU Shu-juan1， LAN Li-qiang1， WEI Yong-tao2
（1 Department of Endocrinology， Qingdao Eighth People's Hospital， Qingdao 266100， China；2 Laboratory Department， Qingdao Eighth People's Hospital， Qingdao 266100， China）

［Abstract］Objective To study the expression level of NLRP3 （NLR family， pyrin domain containing 3） infammasome （NLRP3， ASC， caspase-1） mRNA in peripheral blood monocytes （PBMCs） and serum level of tumor necrosis factor （TNF） -α of patients with acute gouty arthritis （AGA） in the course of it， and the roles of them in pathogenesis in AGA. Methods NLRP3 infammasome mRNA was measured using reverse transcription-polymerase chain reaction （RTPCR） in PBMCs. The expression of NLRP3 infammasome mRNA in PBMCs was compared between patients with AGA （T， n=100 ） and healthy controls （C，n = 100）. T consisted of four stages of disease processχ2: pretherapy （D0）， 3rd day after medications （D3）， 7th day after medications （D7） and 14th day after medications （D14）. TNF-α was measured accordingly using Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） in the two groups. The statistical data were analyzed by IBM SPSS 19.0 software. Result The expression of NLRP3 mRNA in D0， D3 and D7 increased signifcantly when compared to C（P＜0.01）. It was no signifcant difference in D14 when compared to C（P＞0.05）. The expression of ASC mRNA in AGA increased signifcantly when compared to healthy controls. D0， D3 and D7 vs C（P＜0.01）， D14 vs C（P＜0.05）. The expression of caspase-1 mRNA in D0 and D3 increased signifcantly when compared to C（P＜0.01）， while it was in D7 and D14 increased insignifcantly when compared to C（P＞0.05）. Serum level of TNF-α in D0， D3 and D7 increased signifcantly when compared to C （P＜0.01）. While it in D14 increased insignifcantly when compared to C（P＞0.05）.Conclusion Dysregulated expression of the NLRP3 infammasome and IL-18 level are involved in the infammatory response and play key roles in the pathogenesis of the process of AGA.

［Key words］Apoptosis-associated speck- like protein； Caspase-1； NLRP3； Infamm-asome； Arthritis gouty