茯苓菌種不同保藏法的效果比較

楊 祎　邵晨霞　劉惠知　唐少軍　譚明輝　吳勝蓮

（湖南省微生物研究院，湖南　長(zhǎng)沙　410009）

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茯苓菌種不同保藏法的效果比較

楊 祎邵晨霞劉惠知唐少軍譚明輝吳勝蓮*

（湖南省微生物研究院，湖南長(zhǎng)沙410009）

摘 要對(duì)茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)兩個(gè)菌種的斜面保藏、木屑管保藏和液體石蠟保藏效果作試驗(yàn)比較。結(jié)果液體石蠟保藏法保藏茯苓1號(hào)可達(dá)4年，茯苓8號(hào)可達(dá)5年；木屑管保藏法保藏茯苓1號(hào)可達(dá)3年，茯苓8號(hào)可達(dá)4年；斜面低溫保藏方法保藏的2個(gè)茯苓菌種均可達(dá)1年以上。指出短期保藏菌種可選用斜面低溫保藏法，長(zhǎng)期保藏可選擇液體石蠟保藏法或木屑管保藏法。

關(guān)鍵詞茯苓菌種；斜面保藏；木屑管保藏；液體石蠟保藏；時(shí)間

茯苓是最早納入《中國(guó)藥典》的藥用食用菌之一，具有健胃、祛濕、健脾、安神、增強(qiáng)免疫力、抗癌等功效。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前中藥配方中茯苓配伍率達(dá)80％。近年來茯苓已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品和食品領(lǐng)域。我國(guó)湖北、湖南、安徽、云南和福建等地都有較大種植規(guī)模，茯苓產(chǎn)量也不斷增加。茯苓優(yōu)良菌種是栽培生產(chǎn)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，但目前國(guó)內(nèi)推廣的茯苓菌種來源單一，長(zhǎng)期使用導(dǎo)致退化嚴(yán)重，直接影響產(chǎn)量和質(zhì)量。目前食用菌的菌種保藏常用斜面法、甘油法、木屑管法、礦物油法、冷凍干燥法、液氮保藏法等［1］，每種菌種保藏方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。本研究通過對(duì)茯苓菌種的斜面、木屑管、液體石蠟保藏效果進(jìn)行比較，旨在找出易操作的適合茯苓菌種保藏的方法，為茯苓菌種的生產(chǎn)和栽培提供基礎(chǔ)保障。

1　材料與方法

1.1供試菌種

茯苓1號(hào)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種中心提供，茯苓8號(hào)由湖南靖州茯苓菌核分離獲得，湖南省微生物研究院菌種保藏中心保藏。

1.2試驗(yàn)方法

（1）斜面保藏法。斜面菌種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，自然pH。培養(yǎng)基注入玻璃試管，試管口加棉塞，121℃滅菌20 min，60℃烘干棉塞后擺斜面，長(zhǎng)度為1/3試管高，接種茯苓菌種，26℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面，塞子換成已滅菌的橡皮塞，固體石蠟封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（2）木屑管保藏法。木屑管菌種培養(yǎng)基配方：木屑1 000 g，麩皮200 g，蔗糖5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，含水量60％。培養(yǎng)基裝入玻璃試管，容量為管高的2/3，保持培養(yǎng)基松緊適中，擦凈管口塞緊棉塞，用牛皮紙包扎管口后121℃高壓滅菌60 min，60℃烘干棉塞，接種茯苓菌種，26℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)1/2管時(shí)，塞子換成已滅菌的橡皮塞，固體石蠟封口，再用塑料薄膜包封，4℃保藏。

（3）液體石蠟保藏法。取化學(xué)純的液體石蠟裝于試管，加棉塞，瓶口包牛皮紙，121℃高壓滅菌60 min，取出置140℃烘箱中3 h，除去液體石蠟的水分。將上述液體石蠟冷卻至室溫，加入培養(yǎng)好的茯苓斜面菌種試管，液面高出培養(yǎng)基1 cm，塞子換成已滅菌的橡皮塞，用石蠟封口，再用塑料薄膜包封，直立于試管架，4℃保藏。

（4）茯苓菌絲萌發(fā)情況測(cè)定。對(duì) 3種方法保藏的2個(gè)茯苓菌種，在保藏5年期間每年進(jìn)行測(cè)試，將菌種接至斜面，26℃培養(yǎng)，觀察菌絲是否萌發(fā)，設(shè)4個(gè)重復(fù)。

（5）菌絲生長(zhǎng)特性研究。對(duì) 3種方法保藏的2個(gè)茯苓菌種，在保藏期間的第1周、1年、2年、3年分別進(jìn)行測(cè)試，設(shè)4個(gè)重復(fù)。菌種轉(zhuǎn)接至9 cm玻璃平皿，菌塊接種在正中央，26℃培養(yǎng)，待處理長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)測(cè)定各處理菌絲直徑，觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)，計(jì)算菌絲日均生長(zhǎng)速度。日均生長(zhǎng)速度（cm/d）=菌絲直徑/培養(yǎng)天數(shù)。

（6）菌絲酯酶同工酶試驗(yàn)。對(duì) 3種方法保藏1年的2個(gè)茯苓菌種，取培養(yǎng)皿培養(yǎng)的菌絲0.5 g，液氮研磨后加入0.5 mL磷酸緩沖液（pH 7.5），4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗(yàn)。方法參考文獻(xiàn)［2］，采用聚丙酞胺凝膠電泳，點(diǎn)樣量20 μL，電泳結(jié)束后攝像分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同保藏方法、時(shí)間的茯苓菌種萌發(fā)情況

菌種保藏1年，茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)的斜面、木屑管和液體石蠟保藏菌種，接種新斜面后菌絲能正常萌發(fā)（表1）。保藏2年，斜面保藏菌種接種新斜面后不能萌發(fā)，表明斜面保藏茯苓菌種的期限在1～2年之間。保藏3年后，木屑管和液體石蠟保藏茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)均萌發(fā)。茯苓1號(hào)菌種保藏第4年，木屑管菌種未萌發(fā)，液體石蠟菌種保藏第5年菌絲仍萌發(fā)，說明1號(hào)菌種木屑管保藏時(shí)間為3～4年，液體石蠟可保藏5年以上。茯苓8號(hào)菌種保藏第4年，木屑管和液體石蠟保藏的菌種均萌發(fā)；保藏第5年，木屑管和液體石蠟保藏的菌種均未萌發(fā)。兩個(gè)菌種測(cè)試結(jié)果表明，木屑管保藏茯苓菌種可達(dá)3年以上，液體石蠟保藏茯苓菌種至少可達(dá)4年。

表1　不同保藏方法、時(shí)間的茯苓菌種菌絲萌發(fā)情況

表2　不同保藏方法、時(shí)間的茯苓菌種菌絲長(zhǎng)勢(shì)和日均生長(zhǎng)速度

2.2不同保藏方法、時(shí)間的茯苓菌種生長(zhǎng)特性

不同保藏方法、時(shí)間茯苓菌種菌絲生長(zhǎng)特性試驗(yàn)表明（表2），菌種保藏1周，三種保藏方法的菌絲日均生長(zhǎng)速度較快，達(dá)1 cm以上，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，其中液體石蠟的菌絲萌發(fā)晚，日均生長(zhǎng)速度稍慢。茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)菌種保藏1年后，菌絲生長(zhǎng)速度以木屑管保藏種較快，日均分別為1.12 cm和1.09 cm，菌絲長(zhǎng)勢(shì)旺盛；斜面和液體石蠟保藏種菌絲生長(zhǎng)速度較慢，長(zhǎng)勢(shì)一般，與保藏1周的相比菌絲生長(zhǎng)速度有所減慢。茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)菌種保藏2年，木屑管保藏菌種菌絲日均生長(zhǎng)速度高于液體石蠟保藏菌種，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，液體石蠟菌種長(zhǎng)勢(shì)一般。保藏3年后，木屑管和液體石蠟保藏菌種的日均生長(zhǎng)速度接近，菌絲長(zhǎng)勢(shì)都較弱。茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)菌種菌絲生長(zhǎng)特性表現(xiàn)趨勢(shì)為：菌種保藏時(shí)間越長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度越慢；同時(shí)期木屑管菌種比液體石蠟保藏種的菌絲生長(zhǎng)速度快，長(zhǎng)勢(shì)好，原因可能是由于液體石蠟粘在菌塊上，在一定程度上影響菌絲的萌發(fā)和生長(zhǎng)。

2.3不同保藏方法茯苓菌種菌絲酯酶同工酶譜

茯苓菌種保藏1年菌絲酯酶同工酶譜帶分析結(jié)果（圖1），茯苓1號(hào)和茯苓8號(hào)2個(gè)菌種的譜帶基本相同，均為4條，兩邊2條譜帶顏色深且較寬，中間2條譜帶顏色淺且窄。

3種菌種保藏方法的菌絲譜帶相比，斜面和木屑管保藏種的菌絲顏色和寬窄基本相同，液體石蠟保藏菌種的顏色較淺，尤其是茯苓8號(hào)，液體石蠟保藏菌種明顯比另外2種保藏法的譜帶窄，顏色淺。

圖1　2個(gè)茯苓菌種菌絲酯酶同工酶譜帶及模式圖

3　討論

食用菌菌種在長(zhǎng)期保藏中不可避免地出現(xiàn)退化、染雜等情況。因此應(yīng)依據(jù)實(shí)際情況、針對(duì)保藏目的合理選擇保藏方法。Ryan研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于同一種的不同菌株來說，同一保藏方法處理得到的保藏結(jié)果可能不一樣［3］。本研究茯苓1號(hào)菌種液體石蠟保藏5年萌發(fā)，茯苓8號(hào)未萌發(fā)；茯苓8號(hào)木屑管保藏4年萌發(fā)，茯苓1號(hào)未萌發(fā)，兩菌種不同保藏方法的效果存在差異。周龍洋等研究認(rèn)為石蠟油保藏法對(duì)菌絲活力有影響，但適合長(zhǎng)時(shí)間保藏，反復(fù)轉(zhuǎn)接2～3次便可得到活力較好的菌絲［4］。本研究結(jié)果證明，液體石蠟保藏茯苓菌種時(shí)間長(zhǎng)，但保藏1年菌絲長(zhǎng)勢(shì)不如斜面保藏和木屑管保藏法，并且保藏1年酯酶同工酶活性也較低。斜面低溫保藏法比較適合大型真菌的短期保藏，操作簡(jiǎn)單，茯苓栽培基地用于生產(chǎn)的常規(guī)菌種可選這種保藏方法。李羿等研究認(rèn)為，斜面保藏法需4～6個(gè)月轉(zhuǎn)接一次［5］，頻繁轉(zhuǎn)接發(fā)生變異的幾率較高，真空冷凍干燥保藏法適合茯苓母種的長(zhǎng)期保藏，但設(shè)備和技術(shù)要求均較高。專業(yè)的菌種保藏中心需要根據(jù)不同的菌種，選擇兩種以上的保藏方法，木屑管保藏茯苓菌種可作為備選。對(duì)于獲得的野生菌株，應(yīng)盡量減少傳代次數(shù)，較好保藏其基因型等信息，有條件選擇超低溫保藏，可酌情選擇液體石蠟保藏法。

根據(jù)茯苓1號(hào)和8號(hào)菌種保藏1年酯酶同工酶試驗(yàn)結(jié)果，2個(gè)菌種的酶譜帶相同，可能兩菌種遺傳關(guān)系相近或相同。由于我國(guó)茯苓菌種遺傳背景單一，很有可能是同種異名情況。有研究利用比較SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)的大部分主要栽培品種茯苓種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系評(píng)價(jià)，結(jié)果表明供試的主要栽培品種間整體親緣關(guān)系較近［6］。張金霞等研究認(rèn)為酯酶同工酶譜是鑒定草菇菌種保藏效果的可利用的生化標(biāo)志［2］。本研究 3種保藏方法保藏1年菌絲酶譜相同，可能是因未改變菌種的遺傳特性，但未開展保藏1年之后的驗(yàn)證試驗(yàn)。因此保藏若干年后是否發(fā)生遺傳特性改變尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］孔維麗，袁瑞奇，孔維威，等.食用菌菌種保藏歷史、現(xiàn)狀及研究進(jìn)展概述［J］.中國(guó)食用菌，2015，34（5）:1-5.

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［3］Ryan，M.J..The effect of preservation regime on the physiology and genetic stability of economically important fungi［D］.University of Kent，1999.

［4］周龍洋，霍光華，羅貴祥，等.3種保藏方法對(duì)66種大型真菌活力影響［J］.生物災(zāi)害科學(xué)，2013，36（2）:130-136.

［5］李羿，萬德光.茯苓菌種保藏的研［J］.藥生物技術(shù)，2010，17（6）:516-518.

［6］蔡志欣，蔡丹鳳，陳美元，等.32個(gè)茯苓菌株的SRAP分析［J］.食藥用菌，2013，21（2）:96-98.

中圖分類號(hào)：S567.3+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-0934（2016）03-176-04

作者簡(jiǎn)介：楊祎，助理研究員。E-mail：52073200@qq.com

*通訊作者：吳勝蓮，高級(jí)農(nóng)藝師。E-mail：648289145@qq.com