綿羊卵母細胞體外成熟過程中VEGF對DNMT3a表達的影響

曹　忻，鄒云龍，蔡　勇，周　平，李　明，石國慶，康相濤*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002； 2.西北民族大學實驗中心，蘭州 730070；3.新疆農墾科學院畜牧所，石河子 832000)

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綿羊卵母細胞體外成熟過程中VEGF對DNMT3a表達的影響

曹忻1，2，鄒云龍2，蔡勇2，周平3，李明1，石國慶3，康相濤1*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450002； 2.西北民族大學實驗中心，蘭州 730070；3.新疆農墾科學院畜牧所，石河子 832000)

摘要：旨在探究血管內皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在綿羊卵母細胞體外成熟過程中對DNMT3a的影響。本研究采用RNA干擾和顯微注射技術將針對VEGF兩個受體FLT1和KDR/Flk-1的有效干擾片段導入到綿羊卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus-oocytescomplexes，COCs)中，檢測體外成熟培養各時間卵母細胞和顆粒細胞中DNMT3amRNA和蛋白表達水平的變化。結果表明，COCs體外成熟培養過程中，無論是否添加VEGF，卵母細胞內DNMT3amRNA表達量都隨著培養時間延續而降低，培養至8h時DNMT3amRNA表達量急速下降，之后下降速度放緩，至24h后各組趨于一致，且未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01)。添加VEGF組DNMT3amRNA表達量的下降速度快于未添加組。干擾片段導入后發現，FLT1-siRNA和KDR-siRNA復合干擾組干擾效果優于KDR-siRNA干擾組，FLT1-siRNA干擾組干擾效果最弱(P<0.01)。無論是否添加VEGF，在COCs體外成熟培養過程中，顆粒細胞DNMT3amRNA表達量都隨著培養時間延續而降低，且各組表達量差別不大。其中未注射干擾片段對照組的下降速度在COCs成熟培養中期快于其他干擾組(P<0.05或P<0.01)，FLT1-siRNA干擾效果較好。無論是否添加VEGF卵母細胞內DNMT3a蛋白表達量從0～4h上升，之后勻速下降，至16h急速下降，24h為零。未導入干擾片段對照組下降速度最快。其中16h對照組、FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組DNMT3a蛋白表達量，添加VEGF后，分別下降到培養初期的23.12%、31.07%、41.47%和37.90%，未添加VEGF的組則分別下降到培養初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%。顆粒細胞中，添加VEGF組DNMT3a蛋白表達量呈現逐漸下降趨勢，至20h時，已無DNMT3a蛋白表達；未添加VEGF組從0～4h有略微上升，之后呈現逐漸均速下降趨勢，20h時，急速下降，至24h時，無DNMT3a蛋白表達，且干擾片段對DNMT3a蛋白表達影響不大，而本身顆粒細胞中DNMT3a蛋白表達量也不高。結果提示，綿羊COCs體外成熟培養過程中，VEGF加快了卵母細胞中DNMT3amRNA和蛋白表達量的下降速度。而干擾片段的導入則使DNMT3amRNA和蛋白表達量下降速度放緩；顆粒細胞內VEGF的添加和受體干擾片段的導入，對DNMT3amRNA和蛋白表達影響效果不明顯。

關鍵詞：血管內皮生長因子；DNMT3a；卵母細胞；綿羊；體外培養

血管內皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一種促進內皮細胞增生、遷徙，抑制細胞凋亡，提高血管和微血管對大分子物質通透性的生長因子[1-2]，其研究多集中在人類醫學，而關于動物方面的研究報道很少[3-4]。DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)保證基因印跡的建立和維持，DNMT的缺失或功能異常導致基因印跡的異常，這將嚴重阻礙胚胎的正常發育[5-6]。DNMT3a在細胞的生長和調亡中可以起到一定作用，能與P53直接作用而抑制P21的轉錄從而解除P21對細胞增殖的抑制作用[7]。

本課題組的前期研究發現，VEGF是通過綿羊卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus-oocytescomplexes，COCs)體外成熟過程中同時促進卵母細胞核成熟和胞質成熟，以提高卵母細胞成熟率，為后期的體外授精和胚胎發育提供高質量的成熟卵母細胞[8-11]。VEGF是通過存在于卵母細胞和顆粒細胞中的兩個受體FLT1(Thefms-liketyrosinekinase1)和KDR/Flk-1(Kinaseinsertdomainreceptor)相結合而發揮其生物學作用[12]。本研究采用RNA干擾(InterferenceRNA，RNAi)技術將前期研究試驗篩選出的針對VEGF受體FLT1和KDR/Flk-1的兩個有效干擾片段顯微注射到綿羊COCs中進行體外培養，測定不同培養時間DNMT3amRNA和蛋白分別在綿羊卵母細胞和顆粒細胞中的表達變化。探究在綿羊卵母細胞體外成熟過程中，VEGF對卵母細胞的成熟起到的促進作用是否伴隨DNMT3a的表達變化，為后期VEGF在綿羊卵母細胞體外成熟和胚胎發育中的表觀遺傳學研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1綿羊卵巢采集

新疆石河子市牛羊定點屠宰場屠宰的母羊，在30min內用無菌手術剪刀剪下兩側卵巢，置于含青霉素60mg·L-1和鏈霉素100mg·L-1的25～30 ℃生理鹽水中，在3～4h內運回實驗室。隨后用生理鹽水沖洗3或4次至無血水。剪去卵巢上附帶的輸卵管和系膜，隨后在超凈工作臺上用滅菌紗布吸干水分備用。

1.2綿羊COCs采集和體外培養

將準備好的卵巢采用剖切法采集卵母細胞，即將清洗干凈的卵巢置于2%FBS洗卵液的培養皿中，然后用滅菌手術刀片對卵巢表面所有卵泡(2～6mm)進行縱橫方向切割。選取形態正常、胞質均勻并帶有致密卵丘細胞的A、B級COCs，用洗卵液清洗3～4遍，然后在成熟液中清洗1～2遍，放于含有2mL成熟液的30mm培養皿中聚堆培養24h，每堆卵母細胞數量控制在100枚左右，培養條件為38.5 ℃、5%的CO2空氣和飽和濕度。

成熟液成分：TCM199(GIBICOBRL.LotNo.1090183)+10%FBS+10μLFSH(中國科學院動物所)+10μg·mL-1LH(寧波第二激素廠)+1μg·mL-1E2(寧波第二激素廠)。

1.3siRNA干擾片段信息

篩選出的針對FLT1和KDR/Flk-1兩個受體基因進行干擾的雙鏈小RNA干擾片段由上海吉凱基因有限公司設計合成。

表1　siRNA干擾片段信息

1.4顯微注射

在培養前將COCs表面部分顆粒細胞去除后，放入礦物油覆蓋的操作液滴中，用內徑為0.2～0.3μm的注射針吸取20μm的siRNA母液進行顯微注射。每個卵注射約5～9pL的siRNA，然后分組培養。分別收集培養時間為0、4、8、12、16、20、24h的卵母細胞和顆粒細胞進行實時定量和Westernblot檢測。

1.5試驗分組

表 2中“+”表示添加5ng·mL-1VEGF，“-”表示不添加VEGF。VEGF添加劑量根據前期研究結果確定[8-9]。對照組為注射無效的干擾片段；FLT1干擾組為注射篩選出的FLT1-siRNA-2片段；KDR干擾組為注射篩選出的KDR-siRNA-1片段；FLT1和KDR干擾組為復合注射FLT1-siRNA-2及KDR-siRNA-1片段。

1.6RNA提取與cDNA合成

采用FastLineCellcDNAkit(天根生化科技有限公司)試劑盒，對卵母細胞和顆粒細胞進行RNA提取及cDNA第一鏈的合成。

1.7實時定量PCR

針對NCBI提供的mRNA序列，采用Primer5.0以及在線BLAST軟件設計引物，GAPDH為內參。GAPDH (119bp)上游：5′-CCTGCCAAGTATGATGAGAT-3′;下游：5′-TGAGTGTCGCTGTT-GAAGT-3′；DNMT3a(60bp)上游：5′-TGTACG-

表2　試驗分組

AGGTACGGCAGAAGTG-3′；下游：5′-GGCTCC-CACAAGAGATGCA-3′。引物由上海生工合成。

采用羅氏480II實時定量PCR儀進行實時定量PCR擴增。PCR反應體系為LightCycle480SYBRGreenIMaster96模塊標準反應體系，PCR擴增條件為LightCycle480SYBRGreenIMaster96模塊標準擴增條件(退火溫度為60 ℃)。mRNA相對表達量采用2-ΔΔCT進行計算。

1.8Westernblot檢測

取20μL經變性處理后的蛋白質樣品，于SDS-PAGE(10%)分離蛋白。用濕轉法，300mA1h，將電泳后的SDS-PAGE上的蛋白轉移至PVDF膜上，通過彩虹MARK和示蹤染料檢查轉膜效率。將轉移后的PVDF膜用Westernblot封閉液Ⅰ(BSA，pH7.5)室溫封閉1.5h，確保PVDF膜上非特異性的抗體結合位點被封閉。封閉后的PVDF膜經TBST洗滌后用一抗室溫搖床孵育1h。再經TBST洗滌后，PVDF膜用二抗室溫搖床孵育1h。PVDF膜用TBST沖洗兩次，然后用TBST洗滌5min，重復5～6次。用ECL對PVDF膜進行光化學反應后，于暗室用X光片對發光后的PVDF膜進行曝光。Westernblot結果采用QuantityOne分析軟件對蛋白含量做相對定量統計分析并制表。

2結果

2.1綿羊COCs體外成熟過程中添加VEGF卵母細胞DNMT3amRNA和蛋白表達效果

“O+”表示添加5 ng·mL-1VEGF。表達量標注相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標注不同大字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同“O+” represent for adding 5 ng·mL-1VEGF.The expression levels with the same capital letters have no significant difference(P>0.05)；The expression levels with the different capital letters differ significantly (P<0.01).The same as below圖1　COCs培養不同時間時卵母細胞中DNMT3a mRNA表達水平(添加VEGF)Fig.1　DNMT3a mRNA expression level of oocytes at different COCs cultured time(adding VEGF)

從圖1中可以看出，添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，卵母細胞DNMT3amRNA表達量隨著培養時間延續而降低，未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01) 。培養8h是DNMT3amRNA表達量變化的拐點，即各組從培養初期的1.30×10-1驟降到8h的4.00×10-3左右，之后下降速度放緩，至24h時各組趨于一致。16h時FLT1-siRNA干擾組DNMT3amRNA表達量高于KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組表達量外，8h后其余時間點都低于這兩組的測定值，且差異極顯著(P<0.01) 。圖2和表3表明，添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，卵母細胞各個組中DNMT3a蛋白表達量呈現先升高再下降最后為零的變化趨勢，尤其在16h時下降明顯。未注射干擾片段的對照組從0～4h時呈上升趨勢，之后勻速下降，至16h時急速下降為培養初期的23.12%，下降速度最快。注射干擾片段各個組從0～4h呈上升趨勢，之后下降，到16h時FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組DNMT3a蛋白表達量分別下降到培養初期的31.07%、41.47%和37.90%，24h時為0。

2.2綿羊COCs體外成熟過程中未添加VEGF卵母細胞DNMT3amRNA和蛋白表達效果

表3　COCs中卵母細胞DNMT3a蛋白表達水平(添加VEGF)

橫坐標中每組的時間點為0、4、8、12、16、20和24 h。圖4、6和8同The time point of each group in X axis are 0，4，8，12，16，20 and 24 h.The same as Fig.4，Fig.6 and Fig.8圖2　COCs培養不同時間時卵母細胞中DNMT3a蛋白表達水平(添加VEGF)Fig.2　DNMT3a protein expression of oocytes at different COCs cultured time(adding VEGF)

從圖3中可以看出，未添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，卵母細胞DNMT3amRNA表達量隨著培養時間延續呈下降趨勢，未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01)。培養4和8h是DNMT3amRNA表達量變化的拐點，尤其8h驟降，FLT1-siRNA干擾組、KDR-siR-NA干擾組、FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組和對照組從培養初期的1.3×10-1下降到8h的4.80×10-3、4.80×10-3、7.80×10-3和4.00×10-3左右，之后下降速度放緩，至24h時各組幾乎趨于一致。在COCs體外成熟培養過程中，DNMT3amRNA表達量FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組>KDR-siRNA干擾組>FLT1-siRNA干擾組>對照組(P<0.01)。圖4和表4結果表明，未添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，卵母細胞各個組中DNMT3a蛋白表達量呈現從0～4h上升之后勻速下降，到16h后急速下降，最后為零的變化趨勢。未注射干擾片段對照組、FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組DNMT3a蛋白表達量4h時分別上升了5.65%、14.46%、19.30%和22.12%，之后勻速下降，至16h時下降為培養初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%，對照組下降速度最快。

“O-”表示未添加5 ng·mL-1VEGF“O-” represent for without adding 5 ng·mL-1VEGF圖3　COCs培養不同時間時卵母細胞中DNMT3a mRNA表達水平(未添加VEGF)Fig.3　DNMT3a mRNA expression level of oocytes at different COCs cultured time(non-VEGF)

表4　COCs中卵母細胞DNMT3a蛋白表達水平(未添加VEGF)

圖4　COCs培養不同時間時卵母細胞中DNMT3a蛋白表達水平(未添加VEGF)Fig.4　DNMT3a protein expression of oocytes at different COCs cultured time(non-VEGF)

2.3綿羊COCs體外成熟過程中添加VEGF顆粒細胞DNMT3amRNA和蛋白表達效果

從圖5可以看出，添加了VEGF的COCs體外成熟培養過程中，顆粒細胞DNMT3amRNA表達量隨著培養時間延續而降低，且各組表達量差別不大。其中未注射干擾片段對照組的下降速度在12h后快于其他干擾組，尤其快于KDR-siRNA和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組(P<0.05)，而KDR-siRNA干擾組則較其他組略慢。DNMT3amRNA表達量從0h的6.00×10-2左右下降至16h后變為0，并維持到培養結束。圖6和表5可見，添加了VEGF的COCs體外成熟培養過程中，顆粒細胞DNMT3a蛋白表達量呈現逐漸下降趨勢，至20h時已無DNMT3a蛋白表達，且各組差異不大。從0～12h是勻速下降，到16h急速下降，各組下降到培養初期的25.07%。

表達量標注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The expression levels with the same small letters have no significant difference (P>0.05),with the different small letters significant difference (P<0.05)圖5　COCs培養不同時間時顆粒細胞中DNMT3a mRNA表達水平(添加VEGF)Fig.5　DNMT3a mRNA expression level of granule cells at different COCs cultured time(with VEGF)

表5　COCs中顆粒細胞DNMT3a蛋白表達水平(添加VEGF)

圖6　COCs培養不同時間時顆粒細胞DNMT3a蛋白表達水平(添加VEGF)Fig.6　DNMT3a protein expression of granule cells at different COCs cultured time(adding VEGF)

2.4綿羊COCs體外成熟過程中未添加VEGF顆粒細胞DNMT3amRNA和蛋白表達效果

從圖7中可以看出，未添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，顆粒細胞DNMT3amRNA表達量隨著培養時間延續而降低，到20h表達量為0，并持續到卵母細胞成熟，且各組表達量差別不大。其中FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組較其他組DNMT3amRNA表達量略高。未注射干擾片段對照組8和16h時的DNMT3amRNA表達量略低于其他組(P<0.01)。圖8和表6可見，未添加VEGF的COCs體外成熟培養過程中，顆粒細胞DNMT3a蛋白表達量從0～4h有略微上升，之后呈現逐漸均速下降趨勢，20h時急速下降，至24h時無DNMT3a蛋白表達，且各組差異不大。FLT1-siRNA&KDR-siRNA復合干擾組較其他組DNMT3a蛋白表達量略高。20h時各組基本下降到培養初期的24.36%～24.49%。

圖7　COCs培養不同時間時顆粒細胞中DNMT3a mRNA表達水平(未添加VEGF)Fig.7　DNMT3a mRNA expression level of granule cells at different COCs cultured time(non-VEGF)

表6　COCs中顆粒細胞DNMT3a蛋白表達水平(未添加VEGF)

圖8　COCs培養不同時間時顆粒細胞DNMT3a蛋白表達水平(未添加VEGF)Fig.8　DNMT3a protein expression of granule cells at different COCs cultured time(non-VEGF)

3討論

1942年表觀遺傳學的概念“Epigenetics”首次被提出，并指出表觀遺傳與遺傳是相對的[13-14]，主要研究基因型和表型的關系，并將其定義為研究生物發育機制的學科[15-16]。DNA甲基化(DNAmethylation)是表觀遺傳學的調節機制之一[17-18]，它是指在DNA甲基轉移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上[19-20]。哺乳動物的DNMT家族主要成員：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L等[21-22]。有研究表明胚胎中的DNMT3a主要遺傳于卵子并發揮表達作用[23]。在肺癌細胞系A549中，沉默DNMT3a不能誘導細胞調亡[24]。D.Watanabe等[25]發現DNMT3a在卵及受精的胚胎中高表達，隨著胚胎發育至囊胚期逐漸降低。而有關VEGF在綿羊卵母細胞體外成熟及胚胎發育中對DNMT3a的影響少見報道。本研究結果表明，綿羊COCs體外成熟培養過程中，卵母細胞和顆粒細胞都存在DNMT3amRNA表達，且伴隨培養時間的延續表達量呈下降趨勢，說明DNMT3a在綿羊卵母細胞成熟過程中具有階段性和時效性表達。添加VEGF無論是在卵母細胞內還是在顆粒細胞內都加速了DNMT3amRNA表達量的下降，尤其在培養16h之前，當卵母細胞成熟后(24h時)則表達量幾乎趨于一致，說明VEGF在卵母細胞成熟過程中加速DNMT3amRNA表達量的下降。試驗數據顯示，在綿羊卵母細胞體外成熟前8hDNMT3amRNA表達量的下降速度很快，8h以后其下降速度放緩。一個好的、具有發育潛能的卵母細胞要首先獲得生發泡破裂(Germinalvesiclebreakdown，GVBD)的能力，然后才能逐漸獲得完成成熟分裂的能力，以產生高質量的、具有受精能力的卵母細胞[26]。而前期研究結果發現添加VEGF有效促進了綿羊卵母細胞體外培養過程中GVBD的完成[12]。說明DNMT3a的變化主要發生在卵母細胞成熟前期，尤其是生發泡破裂前，判斷VEGF可能由于促進卵母細胞GVBD能力的獲得使得DNMT3amRNA表達量的下降變快。另外本試驗中有效干擾片段導入后DNMT3amRNA表達量的下降速度放緩，說明干擾片段確實有效抑制受體FLT1和KDR的表達，從而影響到DNMT3amRNA表達量下降速度發生變化。其中復合干擾組效果優于KDR干擾組，FLT1干擾組干擾效果最弱(P<0.01)。此外還可通過試驗數據得知，卵母細胞中DNMT3amRNA的表達量高于在顆粒細胞中的，充分證明在綿羊卵丘卵母細胞體外成熟過程中DNMT3a的表達主要體現在卵母細胞中，此時顆粒細胞的輔助作用發揮不明顯。

哺乳動物卵母細胞的大多數RNA在卵母細胞的生長過程中積累并合成，GVBD1h內RNA的合成維持低水平，一些新合成的RNA在GVBD前釋放到細胞質，排卵時停止。因此卵母細胞和早期的胚胎的發育能力依賴于在排卵前mRNA和蛋白的積累[27]。本研究結果顯示，綿羊卵丘卵母細胞體外培養過程中，雖然伴隨培養時間的延續，DNMT3amRNA表達量呈下降趨勢，但其蛋白表達則不同。無論是否添加VEGF，卵母細胞中DNMT3a蛋白表達量從0～4h上升，之后勻速下降，在16h急速下降，最后為0。說明在DNMT3amRNA表達量下降的情況下，為了能更好的完成GVBD，DNMT3a蛋白在關鍵時間點4～8h有強表達，而VEGF的介入使得DNMT3a蛋白下降速度加速，推測是因為添加VEGF較未添加組卵母細胞更好更早的完成整個成熟過程所致，且一旦成熟過程趨于完成，DNMT3a蛋白表達立刻消失。而未導入干擾片段的對照組下降速度最快，說明VEGF受體干擾片段的導入有效提高DNMT3a蛋白的表達。其中在添加VEGF的情況下，KDR干擾組干擾效果優于復合干擾組，FLT1干擾組效果最弱；未添加VEGF組復合干擾組效果優于KDR干擾組，KDR干擾組優于FLT1干擾組，說明KDR受體在整個卵母細胞成熟過程中是VEGF發揮生物學效應的主要途徑。顆粒細胞中，添加了VEGF組DNMT3a蛋白表達量呈現逐漸下降趨勢，至20h已無DNMT3a蛋白表達；未添加VEGF組從0～4h有略微上升，之后呈現逐漸均速下降趨勢，20h急速下降，至24h無DNMT3a蛋白表達，且干擾片段對DNMT3a蛋白表達影響不大。說明VEGF的外源添加和干擾片段的導入對于顆粒細胞中的DNMT3a蛋白表達無影響，且本身顆粒細胞中DNMT3a蛋白表達量也不高。

總之綿羊卵母細胞體外成熟培養是個相當復雜的過程，受到諸多因素的影響，其卵母細胞成熟率仍然顯著低于體內成熟卵母細胞。而VEGF在卵母細胞體外培養系統的改進方面有著積極的促進作用[8-12]，保證了卵母細胞的高成熟率和成熟質量[8]，這種促進作用也影響了DNMT3amRNA和蛋白表達。綿羊卵母細胞體外成熟培養過程中，VEGF加快了卵母細胞中DNMT3amRNA和蛋白表達量的下降速度。而干擾片段的導入則使DNMT3amRNA和蛋白表達量下降速度放緩；顆粒細胞中VEGF的添加和受體干擾片段的導入，對DNMT3amRNA和蛋白表達影響效果不明顯。本試驗結果可為進一步研究綿羊卵母細胞體外成熟過程中DNA甲基化變化奠定基礎。

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(編輯程金華)

TheEffectsofVEGFonDNMT3aExpressioninOocytesMaturationofOvinein vitro

CAOXin1，2，ZOUYun-long2，CAIYong2，ZHOUPing3，LIMing1，SHIGuo-qing3，KANGXiang-tao1*

(1.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Scientific Experimental Center，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730070，China；3.Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science，Shihezi 832000，China)

Abstract:Tostudytheeffectofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)onDNMT3aexpressionduringovineoocytesmaturationin vitro.Inthisresearch,inordertotestDNMT3amRNAandproteinexpressionofoocytesandgranulecells(GCs)atdifferenttimepointsduringcumulus-oocytescomplexes(COCs)culturedin vitro,RNAiandmicroinjectionwereusedtoimport2pairsofeffectivedoublechainsmallinterferingRNA(dsRNA)fragmentswhichweredesignedforVEGFreceptorsFLT1andKDR/Flk-1intoCOCs.Theresultsindicatedthat,duringtheculturingprocessofCOCsmaturationin vitro,theexpressionlevelofDNMT3amRNAofoocyteswouldbedecreasedregardlessofthepresenceofVEGF. DNMT3amRNAexpressionquantityfellsharplyatthe8h,then,itdecreasedslowlyandtendedtobesimilartoeachothergroupsatthe24h. DNMT3amRNAwithoutdsRNAofcontrolgroupsignificantlydeclinedfasterthanthatoftheothertreatmentgroups(P<0.01).TheexpressionlevelofDNMT3amRNAofVEGFgroupsinoocytesshowedafasterdecreasethanthegroupswithoutVEGF.AfterdsRNAfragmentsmicroinjection,interferingeffectofFLT1-siRNA&KDR-siRNAgroupwasbetterthanthatoftheKDR-siRNAgroupandthatofFLT1-siRNAgroupwasthelowest(P<0.01).Duringthematurationprocess, DNMT3amRNAofGCswouldbedecreasedregardlessofthepresenceofVEGF,andthedifferencebetweeneachgroupweretiny.AtthemidmaturityofCOCs, DNMT3amRNAwithoutdsRNAofcontrolgroupdecreasedfasterthanthatoftheothertreatmentgroups(P<0.05orP<0.01),andtheeffectofRNAionFLT1-siRNAgroupwasthebest.WhetheraddingVEGFornot,theproteinexpressionlevelofDNMT3ainoocyteshadbeenincreasingfrominitialtimeuntilthe4h,thenitstartedtodecreaseataconstantspeed.AnoteworthydecreaseofDNMT3aproteinexpressionwasthenobservedatthe16handwascompletelyunexpressedatthe24h.TheproteinexpressionlevelofDNMT3aincontrolgroupwithoutdsRNAhadthefastestdecreasingspeed.Atthe16h,DNMT3aproteinlevelsofthecontrolgroup,FLT1-siRNAgroup,KDR-siRNAgroupandFLT1-siRNA&KDR-siRNAgroupweredecreasedto23.12%, 31.07%, 41.47%and37.90%respectivelywithVEGFcomparingtothatofthe0h.Atthesametime,thatofthenon-VEGFgroupshaddecreasedto37.38%, 54.60%, 57.58%and82.75%.InGCs,DNMT3aproteinexpressionlevelsofgroupswithVEGFdecreasedgraduallysince0handcouldnotbetestedatthe20h,andthatofgroupswithoutVEGFincreasedslightlyfrom0to4h,thenpresentedtheaveragedeclinegraduallyuntilthe20hwherearapiddropappearedandwentcompletelyundetectedatthe24h.Inaddition,dsRNAhadnegligibleeffectonDNMT3aproteinexpressionlevels,whiletheoriginalDNMT3aproteinexpressionlevelintheGCswerelow.Inconclusion,duringtheprocessofCOCsmaturationin vitro,VEGFcouldacceleratethedecreasingspeedofbothmRNAandproteinexpressionlevelsofDNMT3a.dsRNAfragmentsmicroinjectioncouldslowdownthedecreasingspeedofbothmRNAandproteinlevelsofDNMT3a.VEGFanddsRNAhadnoobviousinfluencesonbothDNMT3amRNAandproteinexpressionofGCs.

Keywords:vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)；DNMT3a；oocytes；ovine;in vitro

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.009

收稿日期：2015-07-15

基金項目：國家自然科學基金(31060309)；中國博士后科學基金(2012M511579)

作者簡介：曹忻(1978-)，女，寧夏人，副教授，博士后，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail：caoxin-juliet@163.com，Tel：0931-4512969 *通信作者：康相濤，教授，E-mail：Xtkang2001@263.net

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0484-09