EphA2及EphrinA2在敖漢細毛羊皮膚中的表達及分布規律研究

賀建寧，王春亮，趙金山，程　明，劉開東，劉積鳳，柳　楠*

(1.青島農業大學動物科技學院，青島 266109； 2.公安部南昌警犬基地，南昌 330100； 3.青島市畜牧獸醫研究所，青島 266121)

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EphA2及EphrinA2在敖漢細毛羊皮膚中的表達及分布規律研究

賀建寧1，王春亮2，趙金山1，程明3，劉開東3，劉積鳳1，柳楠1*

(1.青島農業大學動物科技學院，青島 266109； 2.公安部南昌警犬基地，南昌 330100； 3.青島市畜牧獸醫研究所，青島 266121)

摘要：本文旨在探究EphA2及其配體EphrinA2基因在細毛羊毛囊發生、發育過程中的表達與分布規律，為毛囊發育的分子調控機制提供理論基礎。試驗以敖漢細毛羊生長發育不同時期體側部皮膚為材料，采用實時熒光定量PCR和免疫組化技術，對EphA2和EphrinA2基因的mRNA和蛋白水平在皮膚毛囊中的表達規律進行研究。實時熒光定量PCR結果顯示：EphA2和EphrinA2基因的表達量在胎齡120d時顯著高于胎齡90d和出生后1d(P<0.01)；出生后1和30d時差異不顯著(P>0.05)。免疫組化結果表明：EphA2及EphrinA2蛋白在胎齡90和120d、出生后1和30d，4個時期的細毛羊體側皮膚毛囊發育過程中，主要在毛囊、毛母質、外根鞘和表皮中表達，且呈現一定的特異性表達。綜上結果表明，EphA2及EphrinA2與細毛羊皮膚毛囊形態發生、發育過程密切相關，可為相關研究提供借鑒。

關鍵詞：細毛羊皮膚；EphA2；EphrinA2；表達；分布規律

敖漢細毛羊是中國優秀的細毛羊品種之一，其毛囊是皮膚的附屬結構，也是產生被毛的重要組織，它的形態組織結構決定著被毛的品質和產量。毛囊的形態特征及發育規律，對羊毛性狀有重要影響，并受多種因素的調控，其中基因是其最根本的調控因子。EphA2及其配體EphrinA2蛋白是細胞表面型酪氨酸蛋白激酶受體(Protein-tyrosinekinases，PTKs)的一種，都屬于Eph蛋白家族。作為蛋白酪氨酸激酶家族中的最大的成員，Eph家族是外界信息在體內信號傳遞通路的關鍵組成部分，并廣泛參與了各生物學過程的調控[1-2]。EphA2與EphrinA2均為膜蛋白，當只有以細胞膜附著的形式存在時才具有活性，其若要被活化則需要依賴細胞間的近距離接觸[3]。由于其結構中都存在酪氨酸磷酸化的活性結構，故它們所在的細胞具有雙向信號傳遞的功能。Eph受體的正向信號傳遞與經典細胞信號傳遞一樣，當受體結合配體后，受體自身發生酪氨酸激酶磷酸化，并激活多種信號分子，進而通過相應信號通路來調節受體的細胞效應[4]。Ephrin介導的反向信號則向配體所在的細胞進行傳遞，其主要過程：Ephrin與Eph受體結合后，配體胞質區的酪氨酸磷酸化位點發生磷酸化，配體可以與相鄰細胞的EphB受體相互作用，從而誘導細胞內反向信號的產生[5]。有研究表明，Eph/Ephrin系統的雙向信號傳導通路與多個生理和病理過程有關，如正常組織邊界的形成、體節和血管的生成、細胞遷移、骨穩態的調節、腫瘤發生等方面[6-10]。迄今，有關EphA2和EphrinA2基因與細毛羊毛囊發育關系的研究還鮮有報道。本研究旨在通過對敖漢細毛羊皮膚毛囊組織中EphA2和EphrinA2表達量及表達位置變化的研究，了解其對細毛羊毛囊生長發育的作用，以期為毛囊形態發生、發育過程中的調控機制研究提供理論依據，為運用分子生物學加快育種進程提供技術支持。

1材料和方法

1.1試驗動物

分別采集胎齡90、120d及出生后1、30d4個時期敖漢細毛羊體側皮膚，每個時期3只，分別采集兩份2cm2的皮膚樣品，其中一份投入4%多聚甲醛溶液固定，用于石蠟切片制作；另一份投入液氮中，用于總RNA的提取。以上羊均來自同一羊場，飼養管理條件一致。

1.2主要儀器和試劑

羅氏RocheLightCycler480Ⅱ熒光定量PCR系統；羅氏TriPureRNAIsolationReagent，RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit1kit，SYBR?PremixEXTaqTMⅡ(2×)；一抗(博奧森)：RabbitAnti-EphrinA2antibody(bs-9758R)、RabbitAnti-EphA2antibody(bs-10209R)；二抗(Sigma)：Anti-RabbitIgG(wholemolecule)-FITC；LeicaRM2235切片機、FEATHERMICROTOMEBLADER35切片刀、OlympusBX51正置熒光顯微鏡；二甲苯、無水乙醇、4% 多聚甲醛、1%PBS溶液、枸櫞酸緩沖溶液、抗熒光衰減封片劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1引物的設計與合成引物根據GenBank中綿羊相應基因的核苷酸序列，采用Primer5.0軟件設計，由生工生物(上海)有限公司合成，相關引物的基本信息如表1所示，退火溫度為60 ℃。

表1　EphA2、EphrinA2和GAPDH基因引物信息

1.3.2皮膚組織總RNA的提取及cDNA的合成利用Trizol法提取皮膚組織總RNA，并經Bioanalyzer2100(Agilent，CA，USA)檢測合格后用于cDNA的合成。cDNA第一鏈的合成，按照羅氏反轉錄試劑盒的說明書進行。

1.3.3實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR的反應體系20μL：SYBR?PremixEXTaqTMⅡ(2×)10μL，PCR正反向引物(10μmol·L-1)各0.5μL，DNA模板(<100ng)1.0μL，滅菌蒸餾水8.0μL。每個樣品設置3個重復，以GAPDH為內參基因。采用 2-ΔΔCt法計算相關基因的表達量。

1.3.4石蠟切片制備將固定好的皮膚樣品修整為5mm×5mm×3mm的小塊，用PBS緩沖溶液浸泡10h，期間每隔1h更換一次液體；然后采用不同濃度酒精逐級脫水，二甲苯透明。隨后用石蠟(Ⅰ)、石蠟(Ⅱ)、石蠟(Ⅲ) 依次各浸蠟1h，然后包埋于小紙盒內用于下一步試驗。將包埋好的蠟塊修整后固定到切片機上進行連續切片，厚度為5μm，共制得2套切片，1套用于EphA2和EphrinA2的免疫組化分析，另1套用于空白對照。

1.3.5熒光免疫組化常規脫蠟至水后，用PBS緩沖液浸泡10min。然后，在抗原修復盒中加入0.01mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液，將玻片浸入，在98 ℃ 溫度下保持15min后，自然冷卻至室溫。用PBS緩沖液洗3次，每次5min。滴加山羊血清后，放入濕盒中，置于37 ℃ 恒溫箱中20min進行封閉。隨后，傾去封閉血清，并小心拭去組織片周圍的液體，滴加一抗(兔抗綿羊EphrinA2、兔抗綿羊EphA2)1∶150，覆蓋組織片。置于4 ℃ 冰箱過夜，同時利用PBS緩沖液代替一抗，作為陰性對照。用PBS緩沖液洗3次，每次5min，滴加FITC標記的山羊抗兔IgG，覆蓋組織片，放入濕盒內并置于37 ℃ 恒溫箱中30min。用PBS緩沖液洗3次，每次5min，最后用抗熒光衰減劑封片，在熒光顯微鏡下鏡檢觀察并拍片分析。

1.4統計分析

熒光定量PCR結果分析采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，所有數據采用SAS程序t檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結果

2.1總RNA提取

皮膚總RNA提取后，檢測結果如圖1所示，28S和18SRNA條帶明亮，且兩條帶的亮度比值接近2∶1；OD260nm/OD280nm比值為1.8～2.0。表明所提取的總RNA完整性良好，且濃度和純度可以滿足后續試驗要求。

圖1　RNA質量檢測Fig.1　Results of RNA quality

2.2EphA2及EphrinA2實時熒光定量PCR結果

2.2.1EphA2及EphrinA2基因qRT-PCR擴增引物檢測由圖2、圖3可知，EphA2和內參基因GAPDH的熔解曲線峰值圖上只有1個特征峰，表明在實時熒光定量PCR過程中熒光信號均來自特異性引物擴增產物，EphA2和內參基因GAPDH均沒有非特異性擴增及引物二聚體，可以進行下一步的數據分析。

圖2　EphA2和GAPDH熔解曲線Fig.2　The melt curves of EphA2 and GAPDH

2.2.2EphA2和EphrinA2基因的mRNA表達水平由圖4可知，不同時期細毛羊皮膚中EphA2基因mRNA相對表達量：胎齡120 d時顯著高于胎齡90 d和出生后1 d (P<0.01)；出生后30和1 d時差異不顯著(P>0.05)。由圖5可見，不同時期細毛羊皮膚中EphrinA2基因mRNA相對表達量：胎齡120 d時顯著高于胎齡90 d和出生后1 d(P<0.01)；出生后30和1 d時差異不顯著(P>0.05)。結果與EphA2基因mRNA的表達趨勢一致。

2.3EphA2及EphrinA2在細毛羊皮膚發育過程中的分布規律

圖3　EphrinA2和GAPDH熔解曲線Fig.3　The melt curves of EphrinA2 and GAPDH

圖4　不同時期細毛羊體側皮膚中EphA2基因的相對表達量Fig.4　The relative expression level of EphA2 gene in skin of Fine Wool sheep in the different periods

圖5　不同時期細毛羊體側部皮膚中EphrinA2基因的相對表達量Fig.5　The relative expression level of EphrinA2 gene in skin of Fine Wool sheep in the different periods

2.3.1EphA2蛋白在細毛羊皮膚發育過程中表達及分布規律結果表明，EphA2蛋白，在胎齡90 d時，主要在表皮細胞、初級毛囊毛釘上皮細胞中表達(圖6A)；在胎齡120 d時，主要在皮脂腺細胞和毛囊的毛母質細胞及靠近毛球的內、外根鞘集束細胞中表達(圖6B)。在出生后1 d時，主要在表皮細胞、毛囊的毛母質細胞及部分皮脂腺細胞中表達(圖6C)；在出生后30 d時，主要在毛囊的毛母質細胞和外根鞘細胞中表達，在毛干及表皮上皮細胞中僅有少量表達(圖6D)。

2.3.2Ephrin A2蛋白在細毛羊皮膚發育過程中表達及分布規律結果表明，Ephrin A2蛋白，胎齡90 d時，主要在表皮細胞表達，而在初、次級毛囊細胞中幾乎不表達(圖7A)；胎齡120 d時，主要在毛囊外根鞘細胞及毛母質細胞中表達，少量表達于表皮細胞及皮脂腺細胞中(圖7B)；出生后1 d時，主要在毛囊的外根鞘細胞、毛母質細胞和表皮細胞中表達(圖7C)；出生后30 d時，主要在毛囊的毛干細胞、外根鞘集束細胞中表達，少量表達于皮脂腺細胞和表皮細胞中(圖7D)。

EP.表皮；HP.初級毛囊毛釘；HF.毛囊：HM.毛母質；SG.皮脂腺；SWG.汗腺;HS.毛干；ORS.外根鞘。A.胎齡 90 d(400×)；B.胎齡120 d(200×)；C.出生后1 d(100×)；D.出生后30 d(100×)。下同EP.Epidermis；HP.Hair peg；HF.Hair follicle；HM.Hair matrix；SG.Sebaceous gland；SWG.Sweat gland;HS.Hair shaft；ORS.Outer root sheath.A.E90 d of fetal period(400×)；B.E120 d of fetal period(200×)；C.1 d after birth(100×)；D.30 d after birth (100×).The same as below圖6　不同時期的細毛羊皮膚毛囊中EphA2蛋白的表達特征Fig.6　Expression characteristics of EphA2 protein in skin of Fine Wool sheep in the different period

SHG.次級毛囊毛芽。A.胎齡90 d;B.胎齡120 d；C.出生后1 d；D.出生后30 dSHG.Secondary follicles germ.A.E90 d of fetal period；B.E120 d of fetal period；C.1 d after birth；D.30 d after birth圖7　不同時期的敖漢細毛羊皮膚毛囊中Ephrin A2蛋白的表達特征Fig.7　Expression characteristics of Ephrin A2 protein in skin of Fine Wool sheep in the different periods 100×

3討論

細胞外調節蛋白激酶( Extracellular regulated protein kinases，ERK)包括ERK1和ERK2，統稱為ERK1/2，主要通過進入細胞核作用于E1k-1、c-myc、c-jun和ATF等轉錄因子起作用。ERK1/2調控基因的轉錄與表達，主要與細胞的增殖、分化密切相關。EphA2和EphA3則通過抑制ERK信號，從而促進膠質瘤干細胞的自我更新[11]。研究表明，在野生型小鼠中，EphA2的活化能抑制ERK1/2的活性并減少細胞的增殖。在細胞中EphrinA1是ERK1/2 MAPK的活性抑制因子；在角質細胞和成纖維細胞中，EphA2對EphrinA1誘導/抑制ERK1/2 MAPK的活性是必不可少的[12]；通過對小鼠的研究發現，可溶性Eph和Ephrin的胞外模擬肽可以促進毛囊角質細胞的增殖。EphA2和EphrinA1可能通過調節ERK1/2 MAPK的活性，來參與毛囊的凋亡和再生[13]。有研究顯示，破骨細胞中EphrinA2基因的表達，可以激活成骨細胞中的EphA2，進而抑制成骨細胞中某些特異基因的激活[14]。在牙槽骨的成骨細胞中，EphrinA2依賴Ras和ERK1/2的作用，進而抑制成骨細胞標志基因的表達，延遲成骨細胞分化的信號傳遞[15]，而Ras和ERK1/2是EphA2信號系統的主要中間媒介。綜上，EphA2可能通過調節ERK1/2參與了毛囊的凋亡和再生，推斷EphA2/EphrinA2系統可能在毛囊發育中發揮重要作用。本試驗結果表明，EphA2和EphrinA2基因mRNA表達水平，在胎齡120 d時顯著高于胎齡90 d時，在出生后1 d時顯著低于胎齡120 d時，出生后30 d時和出生后1 d時差異不顯著。有研究表明，在胚胎期的后三分之一時間段，細毛羊胎兒的次級毛囊數量增加緩慢，有時甚至停止[2]。這與本試驗結果中，次級毛囊密度在出生后1 d時顯著低于胎齡120 d時，及與EphA2和EphrinA2 mRNA表達量水平趨勢相一致，由此初步推測EphA2和EphrinA2基因可能與此時期毛囊細胞增殖速度降低有一定關系。EphA2和EphrinA2基因mRNA表達趨勢與理論上次級毛囊密度的升降趨勢一致，結合相關研究，綜合推測EphA2/EphrinA2系統可能在誘導次級毛囊再分化為次級毛囊中具有重要作用，但由于樣本量的局限，其具體的作用機制仍需進一步研究。

EphA2作為典型的細胞表面受體，主要在人皮膚角質細胞的外膜上表達，同時也在人正常皮膚的表皮基底層及毛囊內根鞘的角質細胞，以及在小鼠皮脂腺和毛囊的外根鞘中表達[12，16-17]。研究顯示，在小鼠整個毛囊周期中，EphA2在不同的區域表達。在第一個生長期，主要在毛乳頭表達；在靜止期到生長期的過渡階段，則在杵狀毛周圍的一些隆突區的細胞中表達；在第二個生長期，主要在新形成的毛囊周圍的血管內皮細胞中表達，而在表皮和毛囊的上皮細胞內幾乎沒有表達[18]。本試驗研究結果顯示，EphA2蛋白在不同時期敖漢細毛羊皮膚中，主要在毛囊的毛母質細胞、內根鞘細胞和外根鞘細胞及表皮上皮細胞中表達。由于毛母質的生長分化決定毛發的粗細和形狀，會誘導毛囊的再生；內根鞘則包圍毛干，決定毛干的形狀；外根鞘包裹內根鞘，起保護作用；由此推測EphA2蛋白可能在這些部位對細毛羊毛囊形態發育，特別是毛囊再生和細度方面起著一定的作用。綜上，EphA2和EphrinA2蛋白在與毛囊形成和形態變化相關的組織中呈現特異性表達，表明其對毛囊的生長發育具有作用，但其作用機制尚需進一步研究。

4結論

綜上表明，EphA2和EphrinA2的mRNA表達量在細毛羊毛囊發育的不同時期呈現差異性表達，特別在次級毛囊的分化再生過程中表達量顯著升高；其蛋白在與毛囊發育相關的部位特異表達；綜合以上結果及結合相關文獻，推測EphA2和EphrinA2可能參與了毛囊的形態變化和發育過程，可能誘導次級毛囊的再分化，促進毛囊密度的增加。結果可為細毛羊毛囊發育的分子調控機制提供依據。

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(編輯程金華)

ExpressionandDistributionofEphA2andEphrinA2inSkinofAohanFineWoolSheep

HEJian-ning1，WANGChun-liang2，ZHAOJin-shan1，CHENGMing3，LIUKai-dong3，LIUJi-feng1，LIUNan1*

(1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109， China；2.Nanchang Police Dog Base of the Ministry of Public Security，Nanchang 330100， China；3.Qingdao Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao 266121，China)

Abstract:TheobjectivesofthestudyweretoidentifytheexpressionanddistributionofEphA2andEphrinA2geneinhairfolliclesdevelopmentandmorphogenesisofFineWoolsheep.Theresultsmightlayatheoreticalbasisforunderstandingmolecularregulationmechanismofhairfollicledevelopment.SkinsofAohanFineWoolsheepinthedifferentperiod(prenatalstage,E90dandE120d;afterbirth, 1dand30d)wereselected.TheqRT-PCRandimmunohistochemicaltechnologieswereusedtostudytheirlevelsofmRNAandprotein.TheqRT-PCRresultsshowedthatmRNAexpressionlevelofEphA2andEphrinA2geneinE120dweresignificantlyhigherthanthatofE90dand1d(P<0.01)，but1dand30dwerenotsignificantlydifference(P>0.05).Immunohistochemicaldetectionresultsshowedthat,thelevelandlocalizationofEphA2andEphrinA2proteinwerespatialandtemporalspecificityamongE90d,E120d, 1dand30dofsheepskinbodyside.Andtheymainlyexpressedinhairfollicle,hairmatrixouterrootsheathandepidermis.Inconclusion, EphA2andEphrinA2mayplayimportantrolesinhairfollicledevelopmentandmorphogenesis.Theseresultswouldprovidefundamentalinformationfortherelatedresearchfields.

Keywords:finewoolsheepskin；EphA2；EphrinA2；expression；distribution

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.012

收稿日期：2015-09-08

基金項目：國家絨毛用羊產業技術體系專項資金(CARS-40)；國家自然科學基金項目(31402047)；青島農業大學高層次人才科研基金(631410)

作者簡介：賀建寧(1984-)，男，陜西靖邊人，博士，從事羊遺傳育種與繁殖研究，Tel：0532-88030498，E-mail：hexingxing104@163.com *通信作者：柳楠，教授，博士，E-mail：nanliu@sina.com

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0509-06