阿托伐他汀對顱腦外傷后小膠質細胞激活的影響

郁龔杰，孫東東，曾勇，高偉偉，陳思親，張建寧

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阿托伐他汀對顱腦外傷后小膠質細胞激活的影響

郁龔杰1，孫東東1，曾勇1，高偉偉1，陳思親2，張建寧1

摘要：目的觀察阿托伐他汀對顱腦損傷（TBI）后小膠質細胞激活的影響。方法將60只C57/BL6小鼠隨機分為假手術組、生理鹽水組和阿托伐他汀組，各20只。生理鹽水組和阿托伐他汀組采用液壓打擊法制作TBI模型。假手術組不進行液壓打擊。阿托伐他汀組打擊后1 h給予阿托伐他汀（每天1 mg/kg）灌胃，連續7 d。生理鹽水組給予等量生理鹽水灌胃。采用免疫組化法檢測造模后第1、3、7天創傷灶周圍小膠質細胞特異性標志物（Iba-1）的數量及第3天基質金屬蛋白酶（MMP）-9水平；Western blot檢測炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。結果造模后第1、3、7天，阿托伐他汀組小鼠創傷灶周圍Iba-1陽性表達量較生理鹽水組均顯著降低（80.00±7.44 vs.118.40± 6.65，85.60±10.87 vs.189.00±7.51，69.40±5.54 vs.102.40±10.89，P＜0.05）。TBI后第3天，阿托伐他汀組MMP-9陽性表達量與生理鹽水組相比也顯著下降（86.80±8.40 vs.133.80±8.46，P＜0.05）；Western blot檢測發現阿托伐他汀組與生理鹽水組相比TNF-α表達下降（0.64±0.01 vs.0.97±0.02，P＜0.05）。結論阿托伐他汀能減少小鼠TBI后小膠質細胞的激活，減少炎癥因子的表達，起到抗炎作用。

關鍵詞：顱腦損傷；小神經膠質細胞；基質金屬蛋白酶9；腫瘤壞死因子α；阿托伐他汀

顱腦外傷（TBI）是神經外科的常見病和多發病，具有較高的致死率和致殘率，是45歲以下青壯年的主要死因［1-2］。小膠質細胞是中樞神經最重要的固有免疫細胞和主要的效應細胞，TBI發生后，腦內的小膠質細胞被激活來清除損傷的細胞和組織。但是小膠質細胞過度激活后識別“自己”的能力減弱，在發揮“清道夫”作用的同時可將正常血腦屏障（BBB）組織一并損傷，其分泌的腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導顱內免疫炎癥反應，進而促進顱腦繼發性損傷的發生［3］。研究表明，阿托伐他汀屬于β-羥基-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，具有抗氧化和抗炎作用，能減少繼發性血管損傷和血栓形成。本研究旨在觀察阿托伐他汀對TBI后小鼠創傷灶周圍小膠質細胞激活的影響，探討其在TBI中的作用。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑液壓沖擊裝置（美國NEWSUN公司，MODEL01-B）、小動物立體定向固定架（天津市神經病學研究所，TJNS-I）、數字存儲示波器（美國Tektronix，TDS2012）、小動物呼吸機（TKR-200C型）等。10%水合氯醛（天津醫科大學總醫院藥劑科）、多聚甲醛（武漢博士德公司）、阿托伐他汀（杭州默沙東公司）。小膠質細胞特異性標志物（Iba-1，日本wako公司，0.01 mol/L，一抗稀釋液稀釋），基質金屬蛋白酶-9（MMP-9，0.01 mol/L，一抗稀釋液稀釋）、TNF-α（美國Abcam公司）、β-肌動蛋白（β-actin，美國CST公司）及相應二抗（山羊抗兔，中山金橋公司）。

1.2實驗動物及分組健康成年雄性C57/BL6小鼠60只，清潔級，體質量20～25 g，購自中國軍事醫學科學研究院，安靜、溫暖、避強光環境中飼養48 h。按照簡單隨機抽樣法將60只小鼠分為假手術組、生理鹽水組和阿托伐他汀組，各20只。

1.3動物模型制作及處理采用McIntosh等［4］的方法制備液壓打擊TBI模型。選擇前囟點后方2 mm，矢狀縫右側2 mm作為圓心，用磨鉆磨出一個直徑為2 mm的骨孔。保證硬膜完好。小鼠液壓打擊壓力為1.620 8×105～1.823 4×105Pa，沖擊時程約為20 ms。假手術組小鼠僅行頭皮切開和磨開骨孔，不進行液壓打擊。阿托伐他汀組在液壓打擊后1 h至第7天給予1 mg/（kg·d）阿托伐他汀灌胃，生理鹽水組同時給予等量生理鹽水灌胃。

1.4免疫組織化學法檢測腦組織中Iba-1和MMP-9的表達情況造模后各組隨機抽取5只小鼠，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛心室灌注，開顱取腦，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24 h，然后常規脫水，石蠟包埋，以創傷灶為中心制作切片，連續5張，厚5 μm。將切好的散片脫蠟；切片入枸櫞酸鹽緩沖液微波加熱進行抗原修復30 min；切片置入3%H2O2中抑制內源性過氧化物酶10 min，蒸餾水洗5 min；切片入3%牛血清白蛋白（BSA）室溫下封閉1 h；后直接以兔抗小鼠Iba-1單抗1∶500，兔抗小鼠MMP-9單抗1∶200，4℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5 min；切片入1∶200生物素標記的二抗（5%BSA稀釋）2 h；PBS洗3次，每次5 min；辣根過氧化物酶（HRP）-生物素偶聯的三抗室溫孵育1 h；二氨基聯苯胺（DAB）顯色，顯微鏡下控制顯色時間；蘇木素復染；脫水封片。以上所有試劑除一抗外均購自北京中山生物制劑有限公司。各實驗組每份標本在光鏡下隨機采集目標區域5個視野，計算陽性細胞數。所有計量數據由2名非實驗人員按照雙盲原則進行檢測。

1.5Western blot檢測TNF-α液壓打擊后第3天，10%水合氯醛麻醉小鼠取腦，加入1 mL裂解液，組織粉碎，勻漿；離心，取上清液，采用二奎林甲酸（BCA）法測定蛋白濃度并定量；經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）并轉膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；將膜與1∶1 000稀釋的TNF-α、β-actin，抗體4℃孵育過夜，室溫下與相應二抗孵育2 h，增強型化學發光試劑（ECL）顯示。以β-actin為內參對照，結果以TNF-α/β-actin的吸光度比值表示。

1.6統計學方法應用SPSS 16.0統計軟件分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，兩組樣本比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1創傷灶周圍小膠質細胞計數結果液壓打擊后第1、3、7天免疫組織化學顯示阿托伐他汀組小鼠創傷灶周圍小膠質細胞特異性標志物Iba-1陽性表達量與生理鹽水組比較顯著減少（P＜0.05），見圖1。

Fig.1　Comparison of the positive cells of Iba-1at different time points between two groups圖1　小鼠TBI后創傷灶周圍Iba-1陽性表達量比較

2.2MMP-9檢測結果外傷后第3天阿托伐他汀組小鼠MMP-9陽性表達量較生理鹽水組小鼠顯著減少（86.80±8.40 vs.133.80±8.46，t=8.807，P＜0.05），見圖2。

Fig.2　The MMP-9 expression at the 3rd day after TBI between two groups（IHC，×200）圖2　小鼠TBI后第3天創傷灶周圍MMP-9的表達量（IHC，×200）

2.3TNF-α檢測結果外傷后第3天阿托伐他汀組小鼠TNF-α與生理鹽水組相比降低明顯（0.64± 0.01 vs.0.97±0.02，t=8.701，P＜0.05），見圖3。

Fig.3　Results of Western blot assay for TNF-α/β-actin at the 3rd day after TBI圖3　TBI后第3天Western blot檢測TNF-α結果

3　討論

TBI分為原發性和繼發性腦損傷，TBI后的免疫炎癥反應所致的BBB繼發性損傷是繼發性腦損傷發生的關鍵。原發性腦損傷發生于TBI后的瞬間，治療干預困難。繼發性腦損傷的發生發展過程相對較長，是臨床救治的重點［1-2，5］。小膠質細胞在中樞神經系統分布較廣，約占膠質細胞的10%～20%。TBI后，小膠質細胞被激活，其分泌的炎癥介質TNF-α、白細胞介素（IL）-1等是促進繼發性腦損傷發生的關鍵因素［3］。MMPs是一組同源的以無活性酶原形式分泌的鋅依賴性中性蛋白酶，在正常腦組織中發揮重要的作用，比如神經發生、鞘磷脂形成、軸突生長等，而在腦外傷早期的病理發展中有損傷作用［6-7］。小膠質細胞激活后可以促進MMPs表達，對局部多巴胺能神經元膜的結構和功能產生損害，使多巴胺能神經元變性、壞死［8-10］。

他汀類藥物作為HMG-CoA抑制劑是最重要的降脂藥物之一，廣泛用于心腦血管疾病中抗動脈粥樣硬化的治療［11-12］。近年大量研究發現其除降脂作用外，還包括抗炎、免疫調節、抗氧化等，因而在治療免疫介導的疾病如多發性硬化、器官移植排斥等方面具有令人矚目的應用前景。本課題組近年來研究已經證實阿托伐他汀對腦外傷模型的小鼠具有抗炎作用［13-14］，但對究竟如何起到抗炎作用仍未知。

本研究觀察到小鼠TBI后給予阿托伐他汀可以減少創傷灶周圍的小膠質細胞激活，降低TNF-α和MMP-9，證實阿托伐他汀對于TBI后小膠質細胞具有抑制激活的作用，從而影響其參與的神經疾病免疫反應，這可能是阿托伐他汀在TBI中抗炎的機制之一。但阿托伐他汀究竟是如何影響小膠質細胞激活，對于小膠質細胞激活極化是否有影響仍待進一步研究。

參考文獻

［1］Cope EC，Morris DR，Levenson CW.Improving treatments and outcomes：an emergingrole for zinc in traumatic brain injury［J］.Nutr Rev，2012，70（7）：410-413.doi：10.1111/j.1753-4887.2012.00486.x.

［2］Thurman DJ，Alverson C，Dunn KA，et al.Traumatic brain injury in the United States：A public health perspective［J］.J Head Trauma Rehabil，1999，14（6）：602-615.

［3］Loane DJ，Byrnes KR.Role of microglia in neurotrauma［J］.Neurotherapeutics，2010，7（4）：366-377.doi：10.1016/j.nurt.2010.07.002.

［4］McIntosh TK，Vink R，Noble L，et al.Traumatic brain injury in the rat：characterization of a lateral fluid-percussion model［J］.Neuroscience，1989，28（1）：233-244.

［5］Blennow K，Hardy J，Zetterberg H.The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury［J］.Neuron，2012，76（5）：886-899.doi：10.1016/j.neuron.2012.11.021.

［6］Reinhard SM，Razak K，Ethell IM.A delicate balance：role of MMP-9 in brain development and pathophysiology of neurodevelopmental disorders［J］.Front Cell Neurosci，2015，9：280.doi：10.3389/fncel.2015.00280.eCollection 2015.

［7］Egashira Y，Zhao H，Hua Y，et al.White Matter Injury After Subarachnoid Hemorrhage：Role of Blood-Brain Barrier Disruption and Matrix Metalloproteinase-9［J］.Stroke，2015，46（10）：2909-2915.doi：10.1161/STROKEAHA.115.010351.

［8］Mun-Bryce S，Lukes A，Wallace J，et al.Stromelysin-1 and gelatinase A are upregulated before TNF-alpha in LPS-stimulated neuroinflammation［J］.Brain Res，2002，933（1）：42-49.

［9］Rosenberg GA，Cunningham LA，Wallace J，et al.Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain：activation of MMP-9 linked to stromelysin-1 and microglia in cell cultures［J］.Brain Res，2001，893（1/2）：104-112.

［10］del Zoppo GJ，Milner R，Mabuchi T，et al.Microglial activation and matrix protease generation duringfocal cerebral ischemia［J］.Stroke，2007，38（2 Suppl）：646-651.

［11］Zhu FQ，Chen L，Zhu JH.Influence of berberine combining with atorvastatin on serum high-sensitivity C-reactive protein and adipocyte fatty acid-binding protein in patients with acute ischemic stroke［J］.Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2015，15（1）：43-47.［朱飛奇，陳略，朱瑾華.黃連素聯合阿托伐他汀對急性缺血性卒中患者血清超敏C-反應蛋白和脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白水平的影響［J］.中國現代神經疾病雜志，2015，15（1）：43-47］. doi：10.3969/j.issn.1672-6731.2015.01.010.

［12］Zheng XD，Li XQ，Zhang JH，et al.Preliminary study on the efficacy and safety of atorvastatin in northern Han patients with acute ischemic cerebrovascular disease［J］.Med J Chin PLA，2015，40（7）：519-525.［鄭雪丹，李曉秋，張景華，等.阿托伐他汀對北方漢族人群急性缺血性腦血管病有效性和安全性的初步研究［J］.解放軍醫學雜志，2015，40（7）：519-525］.doi：10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.02.

［13］Li T，WangD，Tian Y，et al.Effects of atorvastatin on the inflammation regulation and elimination of subdural hematoma in rats［J］.J Neurol Sci，2014，341（1/2）：88-96.doi：10.1016/j.jns.2014.04.009.

［14］Jin WP，Wang B，Zhao ZL，et al.Effects of atorvastatin on endothelial progenitor cells and neural function in rats with traumatic brain injury［J］.Tianjin Med J，2013，41（5）：465-467.［金衛篷，王彬，趙子龍，等.阿托伐他汀對顱腦損傷大鼠內皮祖細胞和神經功能的影響［J］.天津醫藥，2013，41（5）：465-467］.

（2015-11-01收稿2015-11-30修回）

（本文編輯魏杰）

Effects of atorvastatin on the microglia activation after traumatic brain injury

YU Gongjie1，SUN Dongdong1，ZENG Yong1，GAO Weiwei1，CHEN Siqin2，ZHANG Jianning1
1 Department of Neurosurgery，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin Neurological Institute，Tianjin 300052，China；2 Research Center of Basic Medical Sciences，Tianjin Medical University Corresponding AuthorE-mail:jianningzhang@hotmail.com

Abstract：ObjectiveTo observe the effects of atorvastatin on the microglia activation after traumatic brain injury （TBI）.MethodsSixty adult male C57/BL6 mice were randomly divided into sham group，atorvastatin group and saline group，20 mice for each group.The atorvastatin group and saline group were given hydraulic combat to establish TBI mouse model.The shame group underwent the same surgical procedure without being exposed to percussion injury.The atorvastatin group was treated with atorvastatin（orally，1 mg/kg）1 h after TBI and for 7 consecutive days.The saline group was given saline orally.The expression of microglia（Iba-1+）at the 1st，3rd，and 7th day after TBI and matrix metalloproteinase-9（MMP-9）around the lesion at the 3rd day after TBI were detected by immunohistochemical staining.Tumor necrosis factor（TNF）-α was detected by Western blot assay at the 3rd day after TBI.ResultsThe positive expression of Iba-1+microgliawas significantly decreased in atorvastatin group than that of saline group at the 1st，3rd，and 7th day after TBI（80.00±7.44 vs.118.40± 6.65，85.60±10.87 vs.189.00±7.51，69.40±5.54 vs.102.40±10.89，P＜0.05）.The positive expression of MMP-9 was significantly decreased in atorvastatin group compared with that of saline group at the 3rd day after TBI（86.80±8.40 vs.133.80± 8.46，P＜0.05）.Results of Western blot assay showed that the positive expression of TNF-α was significantly decreased in astorvastatin group than that of saline group at the 3rd day after TBI（0.64±0.01 vs.0.97±0.02，P＜0.05）.ConclusionAtorvastatin can reduce inflammation factor by influencingthe microgliaactivation after TBI in mice.

Key words：craniocerebral trauma；microglia；matrix metalloproteinase 9；tumor necrosis factor-alpha；Atorvastatin

中圖分類號：R651.1+5

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150279

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81271361）；國家自然科學基金重點項目（81330029）

作者單位：1天津醫科大學總醫院神經外科，天津市神經病學研究所（郵編300052）；2天津醫科大學基礎醫學研究中心轉化腫瘤實驗室

作者簡介：郁龔杰（1989），男，碩士在讀，主要從事顱腦外傷的研究

通訊作者E-mail:jianningzhang@hotmail.com