萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光法檢測(cè)奶粉中乳糖和蔗糖的比較研究

郭秀春，郭小白，張苗苗，馬嬌豪，康文藝,*（1.河南大學(xué)藥學(xué)院，中藥研究所，河南 開封　475004；2.開封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封　475004；.河南大學(xué)民生學(xué)院，河南 開封　475004）

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萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光法檢測(cè)奶粉中乳糖和蔗糖的比較研究

郭秀春1,2，郭小白3，張苗苗3，馬嬌豪3，康文藝1,2,*
（1.河南大學(xué)藥學(xué)院，中藥研究所，河南 開封475004；2.開封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封475004；3.河南大學(xué)民生學(xué)院，河南 開封475004）

摘 要：選用市售同種品牌不同年齡段的奶粉，采用萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法對(duì)其乳糖和蔗糖進(jìn)行測(cè)定，分析乳糖和蔗糖的差異，并對(duì)兩種分析方法的結(jié)果進(jìn)行比較，為奶粉中乳糖和蔗糖的檢測(cè)方法提供依據(jù)。結(jié)果表明，萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法相比，高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法測(cè)定乳糖和蔗糖含量的準(zhǔn)確度更高，蔗糖和乳糖的線性范圍均為2～12 mg/mL，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 3、0.999 6，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.53%、3.81%，平均加樣回收率分別為99.70%、101.06%。高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法結(jié)果準(zhǔn)確、分析時(shí)間短、前處理簡(jiǎn)單，適用于快速測(cè)定奶粉中蔗糖和乳糖含量。

關(guān)鍵詞：萊茵-埃農(nóng)氏法；高效液相色譜-示差折光檢測(cè)法；奶粉；蔗糖；乳糖

引文格式：

郭秀春, 郭小白, 張苗苗, 等. 萊茵-埃農(nóng)氏法和高效液相色譜-示差折光法檢測(cè)奶粉中乳糖和蔗糖的比較研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 139-143. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612024. http://www.spkx.net.cn

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糖類是奶粉中比較重要的成分之一，特別是乳糖經(jīng)人體內(nèi)乳糖酶作用后能形成有機(jī)酸，可以促進(jìn)鈣離子的吸收，促進(jìn)有益菌的成長(zhǎng)，有利于腸道健康[1]。但隨著年齡的增長(zhǎng)，腸道中乳糖酶活性急劇下降，因而成年人尤其是高齡人群食用大量的乳糖，不易消化，食物中乳糖含量高于15%時(shí)可導(dǎo)致滲透性腹瀉。此外，研究[2-4]表明，受種族、氣候以及遺傳等諸多因素的影響，有相當(dāng)一部分人的體內(nèi)缺乏乳糖酶，這些人群攝入含有大量乳糖的產(chǎn)品會(huì)出現(xiàn)腸鳴、腹痛、排氣和滲透性腹瀉等“乳糖不耐受”反應(yīng)。蔗糖是常用的食品添加劑之一，常被加入奶粉中以提高含糖量。食用過量蔗糖會(huì)危害身體健康，如蛀牙和肥胖等[1]。由此可見，對(duì)乳制品中的乳糖和蔗糖含量進(jìn)行有效控制就顯得十分必要。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳制品中乳糖的檢測(cè)技術(shù)，有可見分光光度法[5-6]、紅外光譜法[7]、離子色譜法[8]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[9-11]、毛細(xì)管區(qū)帶電泳-間接紫外檢測(cè)法[12]、氣相色譜法[13]、高效薄層掃描法[14]、直接比色法[15-16]、直接滴定法（萊茵-埃農(nóng)氏法）[17-18]等。為此，我國(guó)也相繼出臺(tái)的關(guān)于食品中乳糖測(cè)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)包括：GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定高效液相色譜法》[19]、GB 5413.5—2010《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定》[17]。本實(shí)驗(yàn)選用市售同種品牌不同年齡段奶粉為研究對(duì)象，采用GB 5413.5—2010中給出的萊茵-埃農(nóng)氏法和優(yōu)化條件后的HPLC-示差折光檢測(cè)法對(duì)奶粉中乳糖和蔗糖含量的測(cè)定，為有效控制奶粉質(zhì)量和指導(dǎo)消費(fèi)者合理消費(fèi)具有指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料

選購(gòu)市售同種品牌適用不同年齡段的9種奶粉為測(cè)試奶粉樣品（表1）。

表1　測(cè)試奶粉樣品信息Table 1 Summary of the information about milk power samples

1.2試劑

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，C A S號(hào)：5 7-5 0-1）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，CAS號(hào)：63-42-3）天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純，≥99.9%）美國(guó)Avantor Performance Materials公司；乙酸鉛溶液、草酸鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸、硫酸銅、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉溶液、酚酞溶液、乙醇、次甲基藍(lán)溶液、費(fèi)林氏液（甲液和乙液）[17]均為分析純；水為Milli-Q超純水機(jī)（Millipore）制備的超純水。

乙酸鋅溶液：21.9 g乙酸鋅加3 mL冰乙酸加水溶解并稀釋至100 mL；亞鐵氰化鉀溶液：10.6 g亞鐵氰化鉀加水溶解并稀釋至100 mL。

1.3儀器與設(shè)備

電子天平美國(guó)Mettler-Toledo公司；DL-1型電爐北京中興偉業(yè)儀器有限公司；W201B型恒溫水浴鍋上海申生科技有限公司；KQ-500DB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；LC-20AT HPLC儀（配置有SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AD四元低壓梯度泵、CTO-20AC柱溫箱、RID-20A示差折光檢測(cè)器）日本島津公司。

1.4方法

1.4.1萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定乳糖和蔗糖

按GB 5413.5—2010中規(guī)定的方法。

1.4.2HPLC法測(cè)定乳糖和蔗糖

1.4.2.1色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-N H2氨基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃，檢測(cè)器溫度35 ℃，流速1.0 mL/min，流動(dòng)相：乙腈-水（75∶25，V/V），進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

混合對(duì)照品貯備液（20 mg/mL）：分別稱取1 g（精確至0.1 mg）經(jīng)過（96±2）℃的干燥2 h后的蔗糖、乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶解并定容至50 mL容量瓶中。

混合對(duì)照品使用液：分別準(zhǔn)確吸取混合對(duì)照品貯備液1.00、2.00、3.00、5.00 mL和6.00 mL于10 mL容量瓶中加水定容，分別相當(dāng)于2.0、4.0、6.0、10.0 mg/mL和12.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2.3供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品（精確至0.1 mg）加入50 mL水溶解，再加入21.9 g/mL乙酸鋅、10.6 g/mL亞鐵氰化鉀溶液各5 mL超聲30 min定容至100 mL，用濾紙過濾棄去初液，取濾液用0.22 μm的濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中待用。

2　結(jié)果與分析

2.1萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定奶粉樣品中乳糖和蔗糖

通過1.4.1節(jié)方法對(duì)9種奶粉中乳糖和蔗糖含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表2所示。由表2可知，經(jīng)萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定，不同年齡段奶粉中均含有乳糖和蔗糖，并且乳糖含量高于蔗糖。其中，中老年奶粉中乳糖含量最高，其次是幼兒、兒童奶粉，其他奶粉中乳糖含量相差不大。而無(wú)添加蔗糖的奶粉樣品5、8和9，經(jīng)萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定卻顯示含有少量蔗糖，可能是由于萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)蔗糖是經(jīng)過鹽酸加熱水解成為果糖和葡萄糖，再測(cè)定還原糖的總量，在水解過程中還可將部分糊精、麥芽糖等組分水解成葡萄糖，故使最后測(cè)定結(jié)果偏高[9]。而無(wú)添加蔗糖的8號(hào)樣品因配料表中含麥芽糖，使得其用萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)得的蔗糖數(shù)據(jù)為（4.31±0.45） g/100 g。因此，萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)乳糖和蔗糖含量，雖然方便快捷簡(jiǎn)便，但因操作原因易引起系統(tǒng)及隨機(jī)誤差，且存在無(wú)法區(qū)分乳糖和其他還原糖等不足[18]。由此表明，萊茵-埃農(nóng)氏法在測(cè)奶粉中乳糖和蔗糖過程中易存在一定的誤差。

表2　萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定乳糖和蔗糖含量（n=6）Table 2 Contents of lactose and sucrose assayed by the Lane-Eynon's method (n=6)

2.2HPLC法測(cè)定奶粉樣品中乳糖和蔗糖

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

2.2.1.1流動(dòng)相選擇

通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的配比來(lái)優(yōu)化各組分的保留時(shí)間及分離度。分別用乙腈體積分?jǐn)?shù)為70%、75%、80%和85%的流動(dòng)相進(jìn)行了分離度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，分離時(shí)間隨著流動(dòng)相中水的比例的提高而縮短，但分離度會(huì)下降，蔗糖峰會(huì)與樣品中其他糖的峰部分重疊；降低流動(dòng)相中水的比例能使分離度變大，但分離時(shí)間延長(zhǎng)，峰展寬嚴(yán)重。當(dāng)乙腈和水的體積比為75∶25，流速為1.0 mL/min時(shí)，樣品中的分離效果令人滿意。

2.2.1.2檢測(cè)器溫度選擇

示差折光檢測(cè)器對(duì)環(huán)境的溫度比較敏感，溫度變化明顯，基線會(huì)出現(xiàn)漂移或波浪起伏。在設(shè)定檢測(cè)器的溫度為30、35 ℃和40 ℃時(shí)，發(fā)現(xiàn)在35 ℃溫度的條件下效果好。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品中乳糖和蔗糖的測(cè)定結(jié)果

將1.4.2.2節(jié)制備得到的不同質(zhì)量濃度的乳糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.4.2.1節(jié)條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定，得到了不同質(zhì)量濃度的乳糖和蔗糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖（圖1）。通過HPLC測(cè)定數(shù)據(jù)，分別繪制蔗糖和乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在2～12 mg/mL范圍內(nèi)乳糖和蔗糖質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，其線性方程及相關(guān)系數(shù)檢出限見表3。取線性范圍內(nèi)最低質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，逐步稀釋后，按1.4.2.1節(jié)條件下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，信噪比為3時(shí)的相應(yīng)質(zhì)量濃度或注入儀器的量即為檢出限[20]。測(cè)得蔗糖和乳糖的檢出限分別為0.030 mg/mL 和0.024 mg/mL。

圖1　2種糖的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig. 1　Chromatogram of mixed sugar standards

表3　蔗糖和乳糖的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)與檢出限Table 3 Linear regression equations, linear ranges, correlation coefficients and limits of detection for sucrose and lactose

2.2.3奶粉樣品中乳糖和蔗糖的HPLC圖

圖2　9種奶粉樣品的HPLC圖Fig. 2　HPLC profiles of 9 milk powder samples

表4　HPLC-示差折光檢測(cè)法測(cè)定乳糖和蔗糖含量（n=3）Table 4 Contents of lactose and sucrose assayed by HPLC-RID (n=3)

利用配備有示差折光檢測(cè)器的HPLC儀，按照1.4.2.1節(jié)的方法對(duì)9種奶粉樣品中的乳糖和蔗糖含量進(jìn)行了測(cè)定。由圖2和表4可知，在無(wú)添加蔗糖的奶粉樣品5、8、9中未檢測(cè)出蔗糖，符合樣品無(wú)添加蔗糖的特點(diǎn)。9種奶粉樣品中均含有乳糖，且幼兒、兒童奶粉樣品中乳糖含量最高，其次是中老年奶粉。幼兒、兒童奶粉中乳糖的作用主要是有益于幼兒和兒童的腦部發(fā)育，以及促進(jìn)鈣吸收和體內(nèi)有益菌生長(zhǎng)等。而中老年奶粉中乳糖含量高可能是為了有助于預(yù)防骨質(zhì)疏松、體內(nèi)有益菌生長(zhǎng)、延緩動(dòng)脈硬化的形成[21]等，但不適合乳糖酶缺乏者食用。青少年和適合全家人飲用的奶粉類樣品中乳糖量處于中等水平。

2.2.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20,22]

精密吸取1.4.2.2節(jié)的某一質(zhì)量濃度的蔗糖、乳糖的混合對(duì)照品溶液20 μL，注入色譜儀，按1.4.2.1節(jié)的色譜條件操作，記錄色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)量蔗糖和乳糖的峰面積，計(jì)算蔗糖和乳糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.35%、3.70%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

精密吸取1.4.2.3節(jié)的某一含有蔗糖、乳糖的供試品溶液20 μL，注入色譜儀，按1.4.2.1節(jié)色譜條件操作，記錄色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別測(cè)量蔗糖和乳糖的峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果見表5。從表5可見，蔗糖和乳糖的RSD分別為2.53%、3.81%，說(shuō)明方法的精密度良好。

表 5　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 　Results of precision test

2.2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果[23]

精密吸取1.4.2.3節(jié)的某一供試品溶液20 μL，注入色譜儀，按1.4.2.1節(jié)的色譜條件操作，在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，分別測(cè)量蔗糖和乳糖的峰面積，計(jì)算RSD分別為3.71%、3.24%，結(jié)果表明供試品中蔗糖和乳糖在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果[20]

精密稱取某一奶粉樣品6 份，按1.4.2.3節(jié)的方法制備蔗糖和乳糖供試品溶液，按1.4.2.1節(jié)的色譜條件操作，均進(jìn)樣1 次，分別測(cè)量樣品中蔗糖和乳糖的峰面積，計(jì)算RSD分別為3.14%、4.67%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果[23-24]

取已知含量的樣品粉末約2 g，平行18 份；9 份用于蔗糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)，分為3 份3 個(gè)水平，分別加入含量相當(dāng)量80%、100%、120%的蔗糖對(duì)照品，按1.4.2.3節(jié)的方法制備成溶液，每次進(jìn)樣20 μL；同樣，9 份用于乳糖加樣回收率實(shí)驗(yàn)，分為3 份3 個(gè)水平，分別加入含量相當(dāng)量80%、100%、120%的乳糖對(duì)照品，按1.4.2.3節(jié)方法制備成溶液，每次進(jìn)樣20 μL。記錄色譜圖，測(cè)量蔗糖和乳糖的峰面積，代入回歸方程計(jì)算，并求得蔗糖的平均回收率為99.70%，RSD為3.23%；乳糖的平均回收率為101.06%，RSD為2.05%，結(jié)果見表6。

表6　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6　Results of spike recovery test

由以上可見，HPLC-示差折光檢測(cè)法對(duì)乳糖和蔗糖的測(cè)定具有很好的選擇性、分離性較好、精密度高、穩(wěn)定性重復(fù)性好、回收率高等特點(diǎn)，能夠反映出測(cè)得數(shù)值的準(zhǔn)確性。

2.3萊茵-埃農(nóng)氏法和HPLC-示差折光檢測(cè)法比較

將萊茵-埃農(nóng)氏法和HPLC-示差折光檢測(cè)法測(cè)定蔗糖和乳糖的含量繪制成柱形圖（圖3），將兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較。

圖3　2種檢測(cè)方法測(cè)定蔗糖（a）和乳糖（b）含量的結(jié)果比較Fig. 3　Comparison of the results of two methods for the determination of lactose and sucrose

由圖3a顯示，無(wú)添加蔗糖的奶粉樣品5、8、9用HPLC-示差折光檢測(cè)時(shí)均無(wú)檢測(cè)到蔗糖，但用萊茵-埃農(nóng)氏法均測(cè)得含有少量蔗糖。而其余6種奶粉樣品用HPLC-示差折光檢測(cè)法測(cè)得的蔗糖含量要明顯高于萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)得的蔗糖含量。此結(jié)果與文獻(xiàn)[9]測(cè)定結(jié)果一致。由圖3b顯示，1和2號(hào)奶粉樣品用HPLC-示差折光檢測(cè)法測(cè)得的乳糖含量要明顯高于萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)得的乳糖含量。而8和9號(hào)奶粉樣品用萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)得的乳糖含量要明顯高于HPLC-示差折光檢測(cè)法測(cè)得的乳糖含量，這是由于萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)定乳糖時(shí)無(wú)法區(qū)分乳糖和其他還原糖所致[18]。通過兩種方法比較可知，萊茵-埃農(nóng)氏法引起誤差的原因存在不確定性，所測(cè)定的結(jié)果沒有HPLC法準(zhǔn)確度高。

3　結(jié) 論

萊茵-埃農(nóng)氏法測(cè)乳糖和蔗糖含量，雖然方便快捷簡(jiǎn)便，但因操作原因易引起系統(tǒng)及隨機(jī)誤差，且存在無(wú)法區(qū)別乳糖及其他還原糖等不足。而HPLC-示差折光檢測(cè)法對(duì)乳糖和蔗糖含量的測(cè)定具選擇性好、分離性較好、精密度高、穩(wěn)定性重復(fù)性好、回收率高等特點(diǎn)，比較適合奶粉中乳糖和蔗糖的同時(shí)測(cè)定。用HPLC-示差折光檢測(cè)法的9種奶粉樣品中乳糖和蔗糖含量總體情況良好，符合奶粉的真實(shí)品質(zhì)，可以指導(dǎo)消費(fèi)者根據(jù)自身情況來(lái)選購(gòu)奶粉，避免盲目性消費(fèi)，為有效控制奶粉質(zhì)量和指導(dǎo)消費(fèi)者合理消費(fèi)具有指導(dǎo)意義。

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Comparative Detection of Lactose and Sucrose in Milk Powder by Lane-Eynon’s Method and High Performance Liquid Chromatography with Refractive Index Detector

GUO Xiuchun1,2, GUO Xiaobai3, ZHANG Miaomiao3, MA Jiaohao3, KANG Wenyi1,2,*
(1. Institute of Chinese Materia, Pharmaceutical College, Henan University, Kaifeng475004, China; 2. Kaifeng Key Laboratory of Functional Components in Health Food, Kaifeng475004, China; 3. Minsheng College, Henan University, Kaifeng475004, China)

Abstract:Lactose and sucrose in milk powder from the same commercial brand for two different age groups were assayed by the Lane-Eynon’s method and high performance liquid chromatography with refractive index detector (HPLC-RID). The differences in lactose and sucrose contents among different samples were analyzed, and the results of the two methods were compared. It was indicated that the accuracy of the HP LC-RID method was higher than that of the Lane-Eynon’s method. The linear ranges of the HPLC method for sucrose and lactose were both 2–12 mg/mL with correlation coefficients of 0.999 3 and 0.999 6, respectively. The precision, expressed as relative standard deviations, for sucrose and lactose were 2.53% and 3.81%, respectively. The average recovery rates were 99.70% and 101.06%, respectively. The HPLC method had some advantages such as high accuracy, short analysis time, simple sample pretreatment and suitability for rapid determination of sucrose and lactose contents in milk powder.

Key words:Lane-Eynon’s method; high performance liquid chromatography with refractive index detector (HPLC-RID); milk powder; lactose; sucrose

收稿日期：2016-02-15

基金項(xiàng)目：2016年度河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（16IRTSTHN019）；2015年河南省教育技術(shù)裝備和實(shí)踐教育研究立項(xiàng)課題（GZS008）；河南大學(xué)民生學(xué)院2015年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（MSCXCY2015053）

作者簡(jiǎn)介：郭秀春（1982—），女，講師，博士，主要從事活性天然產(chǎn)物研究。E-mail：guoxiuchun1982@163.com

*通信作者：康文藝（1972—），男，教授，博士，主要從事活性天然產(chǎn)物研究。E-mail：kangweny@hotmail.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612024

中圖分類號(hào)：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0139-05