基于空間夾角判據測定水產品中孔雀石綠殘留量

胡祥均，劉 柳，王 捷，姚志湘,*，李登紅，趙 娜（.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州　545006；2.廣西科技大學 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州　545006；.柳州市食品藥品稽查支隊，廣西 柳州　545006）

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基于空間夾角判據測定水產品中孔雀石綠殘留量

胡祥均1,2，劉 柳1,2，王 捷3，姚志湘1,2,*，李登紅1,2，趙 娜1
（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西 柳州545006；2.廣西科技大學 廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州545006；3.柳州市食品藥品稽查支隊，廣西 柳州545006）

摘 要：通過高效液相色譜-光譜聯用采集數據，應用向量-子空間夾角計算判據，建立水產品中孔雀石綠的快速分析方法。先采用全波長紫外-可見光纖光譜儀建立孔雀石綠的標準光譜數據庫，以及市售水產品樣品的紫外-可見光譜數據，再通過高效液相色譜-光譜聯用方法，建立扣除水產品中待測組分孔雀石綠的本底光譜數據庫；運用向量-子空間夾角判據計算草魚、羅非魚、黃蜂魚、海蟹、海蝦、玉米螺樣品中孔雀石綠的含量。結果表明，在0.2～4.0 μg/mL的線性范圍內，孔雀石綠標準工作曲線的線性相關系數r=0.999 7（λ=618 nm），加標回收率為99.24%～109.38%，相對標準偏差小于5.0%。此方法可用于水產品中孔雀石綠殘留量的快速檢測。

關鍵詞：向量-子空間夾角；多波長紫外-可見光譜；高效液相色譜；孔雀石綠

胡祥均, 劉柳, 王捷, 等. 基于空間夾角判據測定水產品中孔雀石綠殘留量[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 222-225. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612040. http://www.spkx.net.cn

HU Xiangjun, LIU Liu, WANG Jie, et al. Determination of malachite green residues in aquatic products based on vector-subspace angle criterion[J]. Food Science, 2016, 37(12): 222-225. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612040. http://www.spkx.net.cn

孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類化工染料，對真菌、細菌、寄生蟲等有致死作用，主要用于治療和預防養(yǎng)殖魚類的小瓜蟲病、鰓霉病、水霉病等[1-2]，如果人體長期食用含有孔雀石綠的魚類，則會產生致癌、致突變等副作用[3]。目前國內外檢測孔雀石綠的方法主要有：分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-質譜聯用法[8-9]、免疫學檢測法[10]、表面增強拉曼光譜法[11]等。其中分光光度法運用廣泛但靈敏度不高，色譜類方法靈敏高但檢測消耗試劑多而費時，酶聯免疫檢測法則需要消除蛋白質的干擾，前處理過程較復雜。近年來，相關文獻[12-13]報道了化學計量學與紫外光譜響應相結合對多組分的同時測定，由于需要大量建模，所以對復雜組分的分析結果仍然不理想。

不同物質的光譜信號均可由空間里的一個向量表示，向量的模代表不同物質的含量，向量的方向代表不同的光譜特征。多組分體系中的不同組分在空間中對應不同方向的向量，那么該體系即為多個向量所構成的空間[14-16]。通過從混合光譜信號中不斷扣減待測組分的純光譜信號，并與不含待測組分的本底光譜數據庫構成新的集合-子空間，從而計算出純組分光譜向量與子空間的夾角，當待測組分被完全扣除時夾角出現最大值，由夾角最大值所需扣減步數即可計算出待測組分在混合體系中的含量。

目前，該分析方法已運用于化妝品中對羥基苯甲酸酯的測定[17-18]、橙汁中苯甲酸鈉的分析[19]，醬油中山梨酸鉀和苯甲酸的測定[20-21]等。本實驗以6種水產品為研究對象，通過建立不含被測組分孔雀石綠的本底光譜數據庫以及孔雀石綠的標準光譜數據庫，根據向量-子空間夾角判據的計算步驟[22-23]，實現水產品中孔雀石綠的快速分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃峰魚、草魚、羅非魚、海蟹、海蝦、玉米螺市售；孔雀石綠標準品（純度不小于98%）德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸銨、石油醚（均為分析純）廣東西隴化工廠；乙腈（色譜純）安徽時聯特種溶劑股份有限公司；對甲苯磺酸（分析純）天津科密歐化學試劑有限公司；鹽酸羥胺（分析純）廣東光華科技股份有限公司；無水乙醇、乙酸（均為分析純）成都科龍化工試劑廠；二次蒸餾水實驗室自制。

1.2儀器與設備

LC-20AT型高效液相色譜儀日本島津公司；Maya2000Pro型紫外-可見光纖光譜儀美國Ocean Optics公司；AL104型電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16G高速離心機上海安亭科學儀器廠。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜-光譜條件

高效液相色譜條件：Agilent C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-乙酸銨（0.125 mol/L、pH 4.5）（20∶80，V/V）溶液；流速1 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。

光譜條件：流動比色皿1 cm；積分時間15 ms；積分20 次；紫外-可見光纖光譜儀掃描波長190～1 100 nm。1.3.2孔雀石綠標準品光譜數據庫的建立

準確稱取0.010 2 g孔雀石綠標準品，用二次蒸餾水溶解，轉移定容至100 mL容量瓶中，得到102 μg/mL孔雀石綠標準儲備液，再用二次蒸餾水稀釋成10 μg/mL的標準儲備液。將10 μg/mL的標準儲備液分別稀釋成0.2～4.0 μg/mL的標準工作液，采集其在波長210～1 100 nm處紫外-可見光譜數據，經最小二乘回歸得到多波長標準光譜數據庫v。

1.3.3本底光譜數據庫的建立

草魚、羅非魚、黃蜂魚、海蟹、海蝦、玉米螺6種水產品，在組織勻漿機中將樣品勻漿粉碎，各稱量5 g至燒杯，加入5 mL乙酸-乙酸銨（0.125 mol/L pH 4.5）溶液和5 mL體積分數80%乙醇溶液，超聲5 min，85 ℃水浴加熱5 min，減壓抽濾，用10 mL體積分數80%乙醇溶液分3 次洗滌肉糜，濾液轉移至25 mL棕色容量瓶中，再加入1 mL體積分數20%鹽酸羥胺溶液和2 mL 0.05 mol/L對甲苯磺酸溶液，用體積分數80%乙醇溶液定容。取2 mL樣品濾液加2 mL石油醚進行振蕩和離心（12 000 r/min）5 min，取下層清液經0.22 μm濾膜過濾得到樣品溶液，分別記為S1～S6。通過高效液相色譜找出被測組分與其他組分完全分離的高效液相色譜條件，然后將高效液相色譜儀與紫外光譜聯用，分別采集樣本S1～S6經過色譜柱完全分離后的全波長紫外光譜數據，分別扣除待測組分孔雀石綠的光譜數據，然后合并各個樣品的本底光譜數據，得到本底光譜數據庫N。

1.3.4待測樣品中孔雀石綠含量的測定

將6種水產品分別按照1.3.3節(jié)進行處理后，分別采集樣品S1～S6的多波長紫外-可見光譜數據，分別記為a1～a6。根據空間夾角判據，計算待測樣品S1～S6中孔雀石綠含量，并與高效液相色譜分析結果對比。

1.3.5加標回收率及精密度的測定

選用草魚、海蟹（S1、S4）為研究對象，分別添加1、2、4 μg/mL孔雀石綠標準溶液，依照1.3.3節(jié)進行處理，計算加標回收率。分別對樣品羅非魚、玉米螺（S2、S6）測定5 次，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

2　結果與分析

2.1孔雀石綠標準光譜庫的建立

以水為參比，使用Maya2000Pro在全波長條件下采集0.2～4.0 μg/mL系列孔雀石綠標準溶液的光譜數據。將不同波長對應的吸光度與對應的孔雀石綠質量濃度作最小二乘回歸，得孔雀石綠的多元線性回歸方程組yi=aix＋bi，即標準光譜數據庫，記為v。孔雀石綠在波長618 nm處的標準工作曲線為：y=0.142 8x－0.006 8，線性相關系數r=0.999 7，表明線性關系良好。

2.2紫外-可見光譜波段選擇

圖1　孔雀石綠標準品及樣本紫外-可見光譜圖Fig. 1　UV-visible spectra of standard and sample S1

本實驗所用Maya2000Pro紫外-可見分光光度計的波長范圍為190～1 100 nm，由圖1可知，孔雀石綠在波長293、425、618 nm處均有吸收。在波長580～750 nm范圍內，孔雀石綠在0.2～4.0 μg/mL范圍內線性關系良好（r＞0.999 5），所以選取波長580～750 nm內的光譜數據進行后續(xù)計算。

2.3建立水產品本底光譜數據庫

2.3.1建立不含孔雀石綠的本底光譜數據庫

圖2　孔雀石綠標準品（a）及樣品SS1、SS4（b）高效液相色譜圖Fig. 2　HPLC chromatograms of standard and samples S1and S4

在最優(yōu)色譜分離條件下，采用高效液相色譜-光譜聯用法，采集扣除待測組分后的光譜數據作為樣品的本底光譜數據庫。由圖2可知，孔雀石綠標準品的出峰時間為5.8～6.4 min，通過扣除樣品中與孔雀石綠具有相同保留時間的光譜數據，剩余光譜數據則作為水產品的本底光譜數據庫。

2.3.2本底光譜數據庫的降維

從高效液相色譜-光譜聯用得到的樣品本底多波長色譜數據陣列，由于數據量較大不利于高效運算，本實驗應用奇異值分解的方式對所得本底光譜數據庫進行降維。在降維之前，需先求出本底光譜數據庫的主成分數，本實驗以二階差分值序列的折點判斷獨立變量數目，即主成分數[24-25]，得到體系主成分數為20，然后應用奇異值分解[U，S，V]=svd（N）對本底光譜數據庫N進行分解降維，得到m階行正交矩陣U、n階列正交矩陣V和奇異值矩陣S，取U的前20 列，作為降維后的本底光譜數據庫N。

2.4市售水產品中的孔雀石綠含量

將數據庫v、N以及待測樣本光譜數據a1～a6導入計算平臺，選取a1～a6的波長580～750 nm范圍內的數據進行運算。以樣品S2為例，設定扣減步長Δ=1 000，將某質量濃度值xi帶入yi=aix＋bi中得vi，經計算，得到樣品S2在估算質量濃度為0.44 μg/mL時對應的夾角和扣減步數的變化圖。如圖3所示，出現最大夾角的步數為908，根據yi=xi×m/Δ，計算得樣品S2中孔雀石綠的含量為0.40 μg/mL。

圖3　樣品SS2夾角與扣減步數變化圖Fig. 3　Release curve (subspace vs. deduction steps) for sample S2

通過計算得到各水產品中的孔雀石綠含量，并與高效液相色譜法測定結果進行對比，如表1所示，相對誤差在±10%范圍內，說明向量-子空間夾角判據的測定結果較好。

表1　向量-子空間夾角判據法與高效液相色譜法比較Table 1 Comparison between vector-subspace angle criterion method and HPLC

2.5加標回收率及精密度結果

計算樣品S1、S4加標回收率，如表2所示，回收率在99.24%～109.38%之間。分別對樣品S2、S6平行測定5 次，計算方法的精密度，結果見表3。測定結果的RSD小于5.0%，分析方法準確可靠，精密度良好。

表2　加標回收率Table 2　Recovery of standard added to samples

表3　精密度實驗結果（n = 5）Table 3　Precision of experimental results (n = 5)

3　結 論

本研究根據向量-子空間夾角判據計算方法，快速測定水產品中孔雀石綠的含量，實驗回收率好、精密度高，可滿足水產品中孔雀石綠含量的檢測要求。該方法對于同類樣品進行檢測時只需進行一次建模，采集各樣品的紫外-可見光譜即可進行定量分析，數據處理高效快捷，可實現水產品中孔雀石綠含量的快速檢測分析。在建立本底數據庫時，通過不斷更新累積本底數據庫，以使得本底數據庫信息更加全面、方法更加完善。

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Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products Based on Vector-Subspace Angle Criterion

HU Xiangjun1,2, LIU Liu1,2, WANG Jie3, YAO Zhixiang1,2,*, LI Denghong1,2, ZHAO Na1
(1. College of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou545006, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou545006, China; 3. The Food and Drag Inspection Team of Liuzhou, Liuzhou545006, China)

Abstract:Based on the data collected with a high performance liquid chromatograph (HPLC)-spectrometer, vector-subspace angle criterion was calculated. A new method was developed to rapidly analyze malachite green residues in aquatic products. Multi-wavelength UV-visible optical fiber spectrometer was applied firstly to set up a malachite green standard spectral database and a spectral database for marketed aquatic product samples. Then using HPLC-spectrometer, a background spectral database of malachite green in aquatic products was created. The vector-subspace angle criterion was applied to calculate the contents of malachite green residues in aquatic products including grass carp, tilapia, yellow catfish, sea crab, shrimp and corn snail. The results showed that within a concentration range of 0.2–4.0 μg/mL, the linear correlation coefficient for the standard curve was 0.999 7 (at 618 nm), and the recoveries of malachite green in spiked samples were 99.24%–109.38%, with a relative standard deviation of less than 5.0%. Thus, this method can be used to rapidly and accurately detect malachite green residues in aquatic products.

Key words:vector-subspace angle criterion; multi-wavelength UV-visible spectroscopy; high performance liquid chromatography (HPLC); malachite green

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612040

收稿日期：2015-10-14

基金項目：廣西科技計劃項目（桂科攻1355010-15）；柳州市科技計劃項目（2015J030201）

作者簡介：胡祥均（1988—），男，碩士研究生，研究方向為過程分析與檢測。E-mail：xiangjun_hu@163.com

*通信作者：姚志湘（1968—），男，教授，博士，研究方向為過程分析技術。E-mail：zxyao@gxut.edu.cn

中圖分類號：O657.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0222-04引文格式：