高效液相色譜法測定“天竺癇康寧膠囊”中膽紅素的含量

張　穎，宋志釗，劉　元

(廣西壯族自治區中醫藥研究院中藥所　廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧　530022)

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高效液相色譜法測定“天竺癇康寧膠囊”中膽紅素的含量

張穎，宋志釗，劉元

(廣西壯族自治區中醫藥研究院中藥所廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧530022)

摘要：目的建立天竺癇康寧膠囊膽紅素含量的高效液相色譜(HPLC)測定方法。方法采用Intersil-C18色譜柱，流動相為甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長為450 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL。結果在該條件下，濃度為2.26～45.2 mg·L-1范圍內，膽紅素峰面積與其濃度呈良好線性關系(r=0.999 6)，平均回收率為97.4%，RSD為2.02%(n=6)。結論該方法靈敏、簡便、準確、重復性好，可作為天竺癇康寧膠囊質量標準的控制指標之一。

關鍵詞：膽紅素/分析；色譜法,高壓液相；天竺黃；膽南星；中草藥

天竺癇康寧膠囊為南寧翠湖醫院院內制劑，由膽南星、天竺黃、人工牛黃、鉤藤、天麻、遠志、冰片、甘草等二十一味藥材組成，具有清化熱痰，息風定驚，開竅定癇等功效，用于痰火內盛所致之癇證發作。原標準采用人工牛黃、冰片、甘草3個薄層鑒別作為質量控制手段，為了提高該制劑質量標準，本文參考文獻[1]建立高效液相色譜法(HPLC)測定膽紅素的含量，以提高該藥質量標準。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters1525高效液相色譜儀，Waters2998紫外檢測儀；Empowers 2色譜工作站及軟件；梅特勒AL104型電子分析天平；KQ-100VDB雙頻數控超聲清洗儀。

1.2試劑與試藥膽紅素對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，供含量測定用，批號10077-201206，含量以98.5%計；天竺癇康寧膠囊(廣西忠寧制藥有限公司、批號為：130901、130902、130903)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Intersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為450 nm，進樣量為10 μL；柱溫為室溫；理論塔板數按膽紅素峰計算應不低于2 000。

2.2線性范圍考察精密稱取膽紅素對照品適量置于棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解，制成0.452 g·L-1膽紅素對照品溶液，精密吸取適量，以三氯甲烷稀釋10倍得45.2 mg·L-1的膽紅素對照品儲備液。精密吸取45.2 mg·L-1的膽紅素對照品儲備液，分別稀釋制成2.26、4.52、9.04、18.1、27.1、45.2 mg·L-1的膽紅素對照品工作溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣10 μL，測定，以濃度C(mg·L-1)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，計算，得回歸方程為：A=53 814C-63 451，r=0.999 6。結果表明：膽紅素進樣濃度在2.26～45.2 mg·L-1之間與峰面積積分值呈線性關系。

2.3供試品溶液的制備取本品研細，混勻，取細粉約2 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，加三氯甲烷25 mL，超聲處理10 min，放冷，加三氯甲烷至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4陰性樣品制備天竺癇康寧膠囊制法中人工牛黃為細粉投料，取缺人工牛黃的處方量，依法制備陰性樣品，

2.5專屬性考察按“2.4”項下陰性樣品。按“2.1”項下色譜條件測定，進樣10 μL，測定，記錄色譜圖，結果在膽紅素保留時間附近未見有色譜峰出現，表明天竺癇康寧膠囊中其他組份對測定無干擾，色譜圖見圖1。

A.膽紅素對照品

B.天竺癇康寧膠囊樣品(批號：130901)

C.陰性樣品

2.6穩定性試驗按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備天竺癇康寧膠囊(批號：130901)供試品溶液1份，分別于0、4、8、12、16 h進行測定，供試品中膽紅素含量的RSD為1.51%，結果表明供試品溶液在16 h內保持穩定。

2.7精密度試驗吸取同一對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進樣6次，測得對照品溶液峰面積RSD為1.49%。

2.8重復性試驗按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備天竺癇康寧膠囊(批號：130901)6份，分別進樣測定，測得膽紅素含量RSD=1.67%(n=6)。結果測得平均值0.094 4 mg·g-1，表明該方法重復性良好。

2.9加樣回收試驗精密稱取天竺癇康寧膠囊(批號：130901)1 g，加入濃度9.04 mg·L-1膽紅素對照品溶液10 mL，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備。結果膽紅素平均回收率為97.4%，RSD=2.02%(n=6)，結果見表1。

表1　加樣回收試驗測量結果(n=6)

2.10樣品測定按供試液的制備及檢測方法，測定3批天竺癇康寧膠囊(批號130901、130902、130903)中膽紅素含量分別為0.095 3、0.091 4、0.093 8 mg·g-1。

3討論

人工牛黃苦，涼，歸肝，心經，清熱解毒，息風止痙，化痰開竅，為天竺癇康寧膠囊臣藥之一。天竺癇康寧膠囊藥味眾多，每味藥處方量較小，因此有必要建立靈敏、簡便、準確、重復性好的方法來控制制劑質量。膽紅素的含量測定方法收載于歷年中國藥典，《中國藥典》2015年版中使用紫外-可見分光光度法測定含量[2]。但紫外法測定易受其他藥味影響[3]，在藥物制劑質量標準研究工作中，許多含有人工牛黃的制劑使用HPLC法測定膽紅素的含量作為控制制劑質量的手段之一[4-9]。在光照條件下，膽紅素極易氧化[10]，但張東方等[11]研究表明，HPLC測定制劑中膽紅素的含量，在避光的條件下，精密度、重復性及回收率可滿足實驗要求。筆者對文獻[4-9,11]采用的流動相進行了摸索試驗，結果甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)的分離效果，且峰型好，滿足分析方法要求，同時做了方法學摸索，結果提取方法超聲(0.089 5 mg·g-1)>回流(0.074 3 mg·g-1)，提取溶劑三氯甲烷(0.094 1 mg·g-1)>流動相(0.013 8 mg·g-1)>甲醇(0.008 3 mg·g-1)，超聲10、20 min結果相差不大，超聲30 min膽紅素含量稍低，提取劑量15 mL(0.098 2 mg·g-1)>25 mL(0.096 4 mg·g-1)>50 mL(0.073 7 mg·g-1)。考慮到供試品取樣體積比較大，最終選擇提取劑量25 mL。根據方法學考察結果，天竺癇康寧膠囊膽紅素的提取以三氯甲烷25 mL作為提取劑，超聲處理10 min。在“2.1色譜條件”下，考察了Intersil C18、Wondasil C18、Apollo C183根不同品牌填料的色譜柱對樣品中膽紅素峰含量影響，結果表明，理論塔板數均在2 000以上，表明該測定該方法測定膽紅素，對色譜柱選擇性不強，適用范圍廣。

參考文獻

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Determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules by HPLC

ZHANG Ying,SONG Zhi-zhao,LIU Yuan

(TheDivisionofTraditionalChineseMedicine,GuangxiInstituteofChineseMedicine&PharmaceuticalScienceGuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineQualityStandards,Nanning，Guangxi530022，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.MethodsThe Intersil-C18column was used,and the mobile phase consisted of Methanol-trichloromethan-1% phosphoric acid (80∶14∶6) with the flow rate at 1.0 mL·min-1.The detection wave length was 450 nm and the sample size was 10 μL.ResultsLinearity of bilirubin was good around 2.26～45.2 mg·L-1，r=0.999 6.The average recovery was 97.4% with RSD less than 2.02% (n=6).ConclusionsThe method is sensitive,simple,accurate and repeatable,which can be applied to the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.

Key words:Bilirubin/analysis;Chromatography,high pressure liquid;Concretio silicea bambusae;Arisaema cum bile;Drugs,chinese herbal

基金項目:廣西壯族自治區衛生廳中醫藥科技專項(GZZJ14-11);南寧市科學研究與技術開發計劃(20143135)

通信作者：劉元，女，主任藥師，研究方向：中藥藥理與新藥研制開發，E-mail:Liuyuan0821@vip.163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.017

(收稿日期：2015-12-01，修回日期：2016-04-27)