急性腦梗死阿司匹林抵抗患者血小板miR-19a表達變化及臨床意義

馬開富，孫　凱，孫炳偉

(襄陽市中心醫院檢驗科，湖北 襄陽　441021 )

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急性腦梗死阿司匹林抵抗患者血小板miR-19a表達變化及臨床意義

馬開富，孫凱，孫炳偉

(襄陽市中心醫院檢驗科，湖北 襄陽441021 )

摘要：目的探討急性腦梗死阿司匹林抵抗患者血小板miR-19a表達變化及臨床意義。方法選取急性腦梗死患者137例，收集臨床資料，利用實時熒光定量PCR技術檢測血小板中miR-19a表達，利用血小板聚集實驗判別阿司匹林抵抗(AR)和非AR，利用Kaplan-Meier法對AR和非AR無終點事件生存時間進行比較。結果137例急性腦梗死患者中，38例(27.7%)發生AR，99例(72.3%)為非AR；AR患者血小板中miR-19a相對表達量為(1.42±0.15)，顯著高于非AR患者血小板中miR-19a相對表達量(1.16±0.14)，差異有統計學意義(t=8.833，P<0.001)；多因素Logistic回歸分析顯示，miR-19a相對表達量上升和合并2型糖尿病是影響AR發生的獨立危險因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)；AR患者中9例(23.7%)發生終點事件，而非AR患者中僅有7例(7.1%)發生終點事件，差異有統計學意義(χ2=7.348，P=0.007)，Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點事件中位時間146.8d，非AR患者無終點事件中位時間169.6d，差異有統計學意義(χ2=7.531，P=0.006)。結論AR患者血小板中miR-19a表達上調，是影響AR發生的獨立危險因素，并可能影響患者預后。

關鍵詞：腦梗死;微Rnas;血小板聚集;阿司匹林抵抗

近年來隨著老齡化進程加快及人們生活方式改變，急性腦梗死發病率呈顯著上升趨勢[1]，嚴重危害人類健康。研究表明[2]，血小板活化、聚集、黏附在腦血管血栓形成中發揮關鍵性作用。抗血小板聚集已是臨床上常規治療急性腦梗死的治療手段[3]，其中，阿司匹林是最為常用的藥物，在腦血管病預防及治療中廣泛應用，然而，臨床發現部分患者在治療過程中會出現阿司匹林抵抗(aspirinresistance，AR)，增加了復發缺血性事件的風險[4]。目前，AR發生的具體機制尚不清楚，研究表明[5]，微小RNA(miRNA)作為機體內調控多種生物學功能的非編碼RNA，在血小板形成、成熟、活化等過程中亦發揮重要調節作用。miR-19a作為miRNA重要類型，在白血病、淋巴瘤等血液系統疾病中發揮重要作用[6]。本研究擬對接受阿司匹林治療的急性腦梗死患者血小板中miR-19a表達變化進行分析，探討其在AR發生中的意義，以期為臨床實踐提供基礎資料。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年3月至2015年9月在襄陽市中心醫院神經內科住院治療的急性腦梗死患者137例，其中男性82例，女性55例，年齡42～78歲，平均年齡(63.8±10.5)歲，病例入選標準：(1)所有患者均符合1995年全國腦血管病會議制定的《各類腦血管疾病診斷要點》標準[7]，并經臨床和CT等影像學檢查確診；(2)均為首次發病，發病時間在72h以內。排除標準：(1)具有心血管動脈粥樣硬化、梗阻性疾病、動脈炎及動脈瘤者；(2)腦出血及栓死后再發出血者；(3)血液系統疾病、惡性腫瘤患者；(4)重要臟器嚴重功能障礙者；(5)近一月內有外科手術史者、使用影響血小板功能藥物者；(6)具有阿司匹林口服禁忌證者。所有患者于入院后開始頓服阿司匹林腸溶片100mg·d-1(批準文號：國藥準字H15020766，生產企業：呼倫貝爾康益藥業有限公司)。本研究經襄陽市中心醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑和設備Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，miR-19a及內參引物均由上海生工公司設計合成，花生四烯酸和二磷酸腺苷購自美國Helena公司，ABI實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，全自動生化分析儀購自美國BeckmanCoulter公司，全自動血小板聚集儀購自上海博士儀器有限公司。

1.3觀察指標觀察所有患者性別、年齡、體質量指數(BMI)、煙酒嗜好、高血壓和2型糖尿病患病等一般臨床資料，以及血糖、血脂、血小板計數、平均血小板體積、血小板比積等生化檢測指標。

1.4標本采集及處理所有患者于服用阿司匹林10d時，留取晨起空腹靜脈血6mL，分裝于兩支抗凝管中，一支用于提取血小板，枸緣酸鈉抗凝，于1 000r·min-1(半徑8cm)離心10min，留取上層富血小板血漿，再次于3 500r·min-1進行離心30min，留取沉淀，加入RNAlater，保存于-70 ℃冰箱以備檢；另一支用于檢測血小板聚集率，于30min內完成實驗操作。

1.5檢測方法

1.5.1利用實時熒光定量PCR技術檢測血小板中miR-19a表達取血小板沉淀，加入細胞裂解液裂解后，利用Trizol總RNA提取試劑盒對總RNA進行提取并檢測純度。用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得模板鏈cDNA，以cDNA為模板用PCR試劑盒完成PCR。miR-19a及內參引物：miR-19a引物：上游：5’-GCAAATCTATGCAAAAC-3’，下游：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6引物：上游：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，下游：5’-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3’。PCR反應條件：92 ℃ 2min，92 ℃ 60s，56 ℃ 30s，76 ℃ 30s，連續進行36個循環。每個樣品均設置三個平行反應復孔。以2-△△Ct法獲得血小板中miR-19a相對表達量。

1.5.2利用血小板聚集實驗判別AR和非AR取靜脈血，于1 000r·min-1進行離心10min，取上層富含血小板血漿，并計數血小板數量，取下層剩余血液再次于3 000r·min-1進行離心15min，留取乏血小板血漿，并用乏血小板血漿對富血小板血漿進行調整，使血小板數量在360×109·L-1。分別取富含血小板血漿和乏血小板血漿置于全自動血小板聚集儀反應杯中，于37 ℃下，攪拌棒攪拌溫浴5min。分別加入誘導劑花生四烯酸和二磷酸腺苷，檢測血小板聚集程度，根據文獻[8]標準，將花生四烯酸誘導血小板聚集率≥20%或二磷酸腺苷誘導血小板聚集率≥70%作為AR。

1.6隨訪所有患者于出院后繼續口服阿司匹林腸溶片100mg·d-1，利用門診或電話對患者進行隨訪，時間為6個月，將死亡、腦梗死、短暫性腦缺血發作、心肌梗死作為終點事件。

2結果

2.1AR發生情況137例急性腦梗死患者中，38例(27.7%)發生AR，99例(72.3%)為非AR。

2.2AR和非AR患者一般資料比較兩組患者在年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、高血壓比例、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、血小板計數、血小板比積和平均血小板體積差異無統計學意義(P>0.05)，AR患者2型糖尿病比例和空腹血糖水平均高于非AR患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3AR和非AR患者血小板中miR-19a表達AR患者血小板中miR-19a相對表達量為(1.42±0.15)，非AR患者血小板中miR-19a相對表達量為(1.16±0.14)，差異有統計學意義(t=8.833，P<0.001)。

2.4AR發生相關影響因素Logistic回歸分析以是否發生AR為因變量，以一般臨床資料、生化檢測指標和miR-19a為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，miR-19a相對表達量上升和合并2型糖尿病是影響AR發生的獨立危險因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)。

表1　AR和非AR患者一般資料比較

2.5AR和非AR患者隨訪中終點事件發生情況兩組患者在隨訪期間均未出現失訪病例，AR患者中9例(23.7%)發生終點事件，而非AR患者中僅有7例(7.1%)發生終點事件，差異有統計學意義(χ2=7.348，P=0.007)。Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點事件中位時間146.8d，非AR患者無終點事件中位時間169.6d，差異有統計學意義(Logrank檢驗：χ2=7.531，P=0.006)，見圖1。

圖1　AR和非AR患者無終點事件生存時間分析

3討論

急性腦梗死作為神經內科常見病和多發病，病因多樣、發病機制較為復雜，其中，血小板活化是血栓形成的重要病理基礎，阿司匹林作為臨床上常用的抑制血小板活化的藥物，可通過不可逆的抑制環氧酶-1而抑制血小板活化、聚集，從而降低心腦血管血栓性疾病的發生[9]。然而，急性腦梗死患者在接受阿司匹林治療過程中約有11%～46%出現AR而影響治療效果[10]。本研究顯示，137例急性腦梗死患者在進行阿司匹林治療過程中，38例發生AR，發生率27.7%，進一步說明AR在急性腦梗死患者中有較高發生率。

miRNA作為具有多種生物學功能的非編碼短小RNA，廣泛存在于生物體內，研究表明[11]，血小板活化時會出現多種miRNA表達變化。miR-19a作為miR-17-92家族重要成員，參與調控了血管發生及穩態，并在血細胞分化中發揮重要作用[12]。本研究顯示，AR患者血小板中miR-19a相對表達量顯著高于非AR患者，說明miR-19a可能參與了AR的發生。本研究顯示，AR和非AR一般臨床資料和生化指標無差異，但AR患者中2型糖尿病比例和空腹血糖水平均高于非AR患者，說明糖尿病是影響AR的因素，與陳哲等[13]研究結論相同。多因素Logistic回歸分析顯示，miR-19a相對表達量上升和合并2型糖尿病是影響AR發生的獨立危險因素(OR=5.13和1.48，P<0.05)，說明miR-19a表達上調是引發AR發生的影響因素。在對所有患者進行隨訪中發現，AR患者中終點事件發生率23.7%，顯著高于非AR患者的7.1%，Kaplan-Meier生存分析顯示，AR患者無終點事件中位時間146.8d，低于非AR患者的169.6d，說明AR是影響急性腦梗死患者不良終點事件發生的危險因素，同時，亦進一步提示miR-19a可能通過影響AR的發生而影響患者預后。

綜上所述，AR患者血小板中miR-19a表達量上調，是影響AR發生的危險因素，而AR是影響患者不良終點事件的危險因素，提示miR-19a可通過影響AR而影響患者預后，因此，miR-19a有望成為早期發現AR及預測患者預后的指標。

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基金項目:江蘇大學附屬醫院面上項目(BK2012703)

通信作者：孫凱，女，副主任醫師，研究方向：免疫檢驗，E-mail：1879469320@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.030

(收稿日期：2016-04-06,修回日期：2016-04-26)