酒糟為基質提取凝血質的白地霉培養條件的優化

田小海，崔洪艷，王 莘

(長春醫學高等專科學校，吉林長春 130031)

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酒糟為基質提取凝血質的白地霉培養條件的優化

田小海，崔洪艷，王 莘

(長春醫學高等專科學校，吉林長春 130031)

摘要[目的]優化從提取凝血質的白地霉培養的酒糟副產物利用的最佳培養基。[方法]先通過正交試驗及單因素試驗確定凝血質的最大提取量，探討利用酒糟為基質培養白地霉的最佳培養基配比，即確定蛋白飼料水、DDGS水、廢糖及酵母泥的最佳配比。[結果]4種營養成分的最佳配比為：蛋白飼料水20 mL、DDGS水120 mL、廢糖1 g、酵母泥1.6 g。在以上條件下培養獲得白地霉的干菌量為1.402 g，獲得粗品的凝血質含量為2.3%。[結論]通過該試驗的研究降低了培養白地霉的培養成本，提高了燃料乙醇發酵副產物及廢糖的利用率，增加了廢棄物的附加值，并開發了凝血質提取和獲得的途徑。

關鍵詞凝血質；白地霉；酒糟；培養條件；優化

凝血系統是機體發揮內源性或外源性凝血途徑的物質基礎，凝血物質一般又分為經典凝血因子和激肽2個系統[1]。凝血質屬于經典凝血因子中的凝血因子Ⅲ，當凝血因子Ⅲ與其受體Ⅶa結合后，可通過啟動外源性凝血途徑而發揮凝血作用[2]。

凝血質的來源較為廣泛，如中藥、微生物、動物等。一些中藥中含有凝血質，但其含量不高，且通過分離提取獲得量少，此外中藥的來源也限制了凝血質的提取。動物源的凝血質從種屬關系的角度來看屬于較為優質的凝血質，但動物體內凝血質含量少，且通過實驗動物途徑獲取的凝血質無法大規模生產。真菌中半知菌綱的真菌含量較為豐富，如酵母菌和白地霉中凝血質含量豐富，且此類真菌容易擴大培養，其分離與提取相對容易，因此微生物是獲得凝血質的理想來源。

通過擴大培養獲得大量真菌，在培養過程中降低培養真菌的消耗，可以通過利用一些廢棄物來完成，如通過燃料乙醇發酵副產物和糖廠廢糖的利用來降低培養基的消耗。筆者通過正交試驗和單因素試驗確定凝血質的最大提取量，探討利用酒糟為基質培養白地霉的最佳培養基配比。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗儀器與耗材。試驗儀器有搖床、多循環水式真空泵、干燥箱、恒溫磁力攪拌器、TDL-5離心機、751分光光度計和PHS-3型酸度計、天平、冰箱；試驗耗材有200目篩網、布氏漏斗、抽濾瓶、比色管。

1.1.2試驗材料。DDGS水和蛋白飼料水，由乾安縣酒精廠提供；廢糖和廢酵母，由糖廠和酵母廠家提供；白地霉菌種，購自于中國科學院微生物研究所。

1.1.3試劑。硫酸銨、硫酸鎂、無水硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂(食品級)、無水乙醇、95%乙醇、乙醚和丙酮，均為分析純。

1.2方法

1.2.1斜面培養。采用馬鈴薯培養基(PDA)對白地霉菌種進行活化，培養條件為28～30 ℃，培養3 d[3]。

1.2.2液體培養[4]。酵母膏2.0 g，葡萄糖3.0 g，磷酸二氫鈉1.5 g，硫酸銨1.5 g，硫酸鎂0.3 g。121 ℃下滅菌20 min，接種后搖床溫度控制于28～30 ℃，搖瓶轉速為110 r/min，搖床培養2 d[5]。

1.2.3特殊培養基培養[6]。在培養基中以DDGS水、蛋白飼料水、廢糖和廢酵母泥為基質進行培養，通過4因素3水平L9(34)的正交試驗確定最佳培養基配比。正交試驗的因素與水平如表1所示。

表1白地霉培養的正交試驗因素與水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test for cultivation ofGeotrichumcandidum

水平Level因素Factor蛋白飼料水Proteinfeedwater(A)∥mLDDGS水DDGSwater(B)∥mL廢糖Wastesugar(C)∥g廢酵母泥Yeastmud(D)∥g120401.00.8240802.01.23601203.01.6

1.2.4生長曲線的繪制[7]。分別對生長1～12 d的白地霉菌體的干菌量進行測定，從培養24 h后開始，每間隔24 h收集1次菌體，由于離心效果差，采用靜置沉降的方法收集菌體[8]，測定前使用200目篩網對發酵液進行過濾，對過濾到的菌體進行烘干處理(50 ℃以下，防止蛋白變性)，烘干后進行稱重。試驗重復3次，取平均值。以發酵天數為橫坐標，以干菌體重為縱坐標，繪制曲線，即為生長曲線。

1.2.5凝血質粗品的提取[9]。用一定濃度的乙醇對白地霉(干菌體)進行浸提(有溫度要求)，獲得提取液；提取液經過濃縮(有溫度要求)，獲得膏狀物；膏狀物經無水硫酸鈉脫水后，再用乙醚提取，獲得乙醚提取液；對乙醚提取液進行濃縮，獲得濃縮物；濃縮物經丙酮沉淀后，獲得凝血質粗品。

2結果與分析

2.1白地霉的生長曲線從圖1可以看出，白地霉的平均干菌重隨著發酵時間的延長而逐漸增加，第9天達到最大值。據報道，白地霉培養第8～10天是凝血質提取的最佳時間[10]，與該研究結果相一致。

2.2白地霉培養的正交試驗結果由表2可知，各影響因素的最佳水平組合為A1B3C1D3，即蛋白飼料水20 mL、DDGS水120 mL、廢糖1.0 g、廢酵母泥1.6 g。各影響因素對白地霉培養的影響從大到小依次為C、A、D、B。其中，廢糖是最大的影響因素，是白地霉生長過程中最主要的碳源，也是能量來源；蛋白飼料水為第2影響因素，是白地霉生長過程中氮的來源。通過正交試驗結果可知，以4種培養基成分的最佳組合再次培養白地霉，獲得白地霉干菌量為1.402 g。

圖1　白地霉的生長曲線Fig.1　Growth curve of G. candidum

表2　白地霉培養的正交試驗結果分析

2.3凝血質粗品提取量從圖2可以看出，凝血質粗品的提取量隨發酵時間的延長而逐漸增加，在第9天達到最大值(0.046 g)，粗提取率達到2.3%。

圖2　不同發酵時間白地霉凝血質粗品提取量的變化 Fig.2　Changes of crude thromboplastin extraction amount of G.candidum under different fermentation time

3結論

白地霉中的凝血質是白地霉在生長繁殖過程中的次級代謝產物，因此在獲得此類代謝產物時大多是在經過初級培養階段之后，與白地霉的生長曲線相吻合。當白地霉的培養獲得最大干菌量時，提取所獲得的粗品凝血質的提取量最大。

研究白地霉的最佳培養方案就是獲得凝血質粗品的最佳方案。為降低白地霉培養的成本，同時增加燃料乙醇發酵副產物的利用以及廢糖和廢酵母的利用，DDGS水是酒精生產過程中的廢水，當其含量超過120 mL時，由于其內毒性因素的作用會對微生物的生長起到抑制作用，因此將120 mL DDGS水設為最上限。

4種營養成分的最佳配比方案為：蛋白飼料水20 mL、DDGS水120 mL、廢糖1 g、酵母泥1.6 g。在以上條件下培養

獲得白地霉的干菌量為1.402 g，獲得粗品凝血質含量為2.3%。通過該試驗研究降低了培養白地霉的培養成本，提高了燃料乙醇發酵副產物及廢糖的利用率，增加了廢棄物的附加值，降低了凝血質的生產成本。

參考文獻

[1] 韓邦志，謝金鮮.中藥止血與凝血機制的研究進展[J].廣西中醫藥，2009，32(2)：6-8.

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[3] 武漢大學，復旦大學.微生物學[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：88-91.

[4] 張紀中.微生物分類學[M].上海：復旦大學出版社，1990：329-330.

[5] 中國科學院微生物研究所.常用與常見真菌[M].北京：科學出版社，1973：67-70.

[6] 楊廉婉，張樹政.白地霉在液體培養基中連續傳代所引起的形態變化[J].微生物學報，1965，11(2)：303-304.

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[9] WANG W，WANG Y J，KELNNER D N.Coagulation factor VIII：Structure and stability[J].International journal of pharmaceutics，2003，259：1-15.

[10] SOLHEIM B G，FLESLAND O，BROSSTAD F，et al.Improved preservation of coagulation factors after pre-storage leukocyte depletion of whole blood[J].Transfusion and apheresis science，2003，29：133-139.

基金項目吉林省教育廳科學技術研究項目[吉教科驗字(2009)141號]。

作者簡介田小海(1980- )，男，吉林乾安人，講師，碩士，從事微生物發酵、生物化學、醫學微生物學與免疫學、生命教育的研究和教學。

收稿日期2016-03-26

中圖分類號S 182

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-012-02

Optimization of Culture Conditions for the Extraction of Thromboplastin fromGeotrichumcandidumwith Lees as the Matrix

TIAN Xiao-hai, CUI Hong-yan, WANG Xin

(Changchun Medical College, Changchun, Jilin 130031)

Abstract[Objective] To optimize the culture condition for extraction of thromboplastin from Geotrichum candidum with lees as the matrix. [Method] Orthogonal test and single factor test were used to determine the maximum extraction amount of thromboplastin. The optimal culture medium composition was obtained with lees as the matrix, which was the ratios of protein feed water, DDGS water, waste sugar and yeast mud. [Result] The optimal formula of the four kinds of nutritional components were 20 mL protein feed water, 120 mL DDGS water, 1 g waste sugar and 1.6 g yeast mud. Under the above conditions, the amount of G. candidum was 1.402 g and the crude thromboplastin content was 2.3%. [Conclusion] This research reduces the cultivation cost of G. candidum, enhances the utilization rate of fuel ethanol fermentation by-products and waste sugar, increases the added value of waste, and develops the approaches for thromboplastin extraction and acquisition.

Key wordsThromboplastin; Geotrichum candidum; Lees; Culture condition; Optimization