接種不同乳酸菌改善納豆芽孢桿菌發酵的全豆豆乳品質研究

武 旭，錢 和

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

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接種不同乳酸菌改善納豆芽孢桿菌發酵的全豆豆乳品質研究

武 旭，錢 和*

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

摘要[目的]改善納豆芽孢桿菌發酵的全豆豆乳品質。[方法]利用納豆芽孢桿菌和不同的乳酸菌共同發酵全豆豆乳，對發酵過程中發酵豆乳的微生物數量、納豆激酶酶活、pH的變化以及豆乳的感官評分進行研究。[結果]試驗表明，利用漢森商業乳酸菌菌種與納豆芽孢桿菌共同發酵全豆豆乳，豆乳中乳酸菌與納豆菌均能夠良好生長，所得發酵豆乳感官評分最高、納豆激酶酶活最高。[結論]研究改善了納豆產品的風味，可為大豆深加工提供參考。

關鍵詞發酵豆乳；混合發酵；乳酸菌；納豆芽孢桿菌；納豆激酶

納豆是一種發酵大豆產品，是由蒸煮過的大豆接種納豆芽孢桿菌發酵而成。國內外研究表明，納豆具有多種保健功效，包括溶解血栓、抗菌消毒、降血壓、抗氧化、助消化、維持腸道健康、防治骨質疏松、抗癌等作用[1]。納豆的食療作用顯著，但納豆有令人不悅的氨嗅味，在我國的消費低于其傳統消費國日本。改善納豆風味的主要方法有簡單加以芥末醬油等調料、添加輔料[2]、控制發酵條件[3]、冷凍干燥[4]、超高壓[5]、混合發酵[6]等。

傳統納豆是固體發酵。液體可以通過管道運輸，發酵過程容易控制，規模易擴大，成分易控制，后續加工較為簡單。采用豆漿，而非全豆進行發酵，擴大生產較為容易。傳統豆制品加工中的制漿工藝，多去皮去渣，造成資源的浪費，同時也對環境造成了污染。以全豆豆漿為原料制備富含納豆激酶的酸豆乳，對大豆進行全利用，避免了對環境的污染。

開發一款風味良好、加工工藝簡單、價格低廉的富含納豆激酶的產品，市場前景廣闊，有利于納豆這一健康食品的推廣。利用全豆豆漿進行發酵，對大豆進行全利用，液體發酵易于工業化生產，基本無副產物產生。筆者利用乳酸菌產酸產香的性質，改善納豆芽孢桿菌發酵帶來的不良風味，通過混合菌種發酵，改善了產品的風味，同時也為大豆的深加工提供一個新思路，有利于提高大豆這種在我國種植廣泛的農作物的附加值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)為實驗室保存菌種；植物乳桿菌(L.plantarum，L.p)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus，L.a)、德式乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus，L.db)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus,S.t)、乳酸乳球菌乳亞種(L.lactis.subsp.lactis，L.l)，由江南大學生物技術實驗中心提供；Hanson商業發酵菌株、Danisco商業發酵菌株、光明ST3商業發酵菌種，在該試驗中縮寫編號依次為H、D、S。

1.1.2主要試劑。纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶，購自中國藥品生物鑒定所；其他化學試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器設備。KS996初粉碎機；膠體磨，廊坊市廊通機械有限公司；高壓均質機，上海市東華高壓均質機廠；FE20型pH 計，祈合電器有限公司；LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫用核子廠；W-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術公司。

1.2方法

1.2.1種子液制備。保存的納豆桿菌菌種由斜面接種到裝有100 mL營養肉湯中，37 ℃下，180 r/min搖床培養16 h，制得納豆菌種子液。乳酸菌菌種，分別由斜面接種到100 mL的MRS培養基中，放在37 ℃培養箱中培養16 h，制得乳酸菌種子液。

1.2.2全豆豆乳的制備。全豆豆乳制備工藝流程：大豆→清洗→浸泡→熱燙→制漿→膠體磨→均質→殺菌→冷卻→接種→發酵→冷藏→成品。選取顆粒飽滿、無霉變、無劣質的優質大豆，洗凈，以豆水比1∶3 g/mL的比例，4 ℃浸泡18 h，0.5%的NaHCO3溶液熱燙，按豆水比1∶8 g/mL磨漿，過膠體磨，40 MPa均質。

1.2.3發酵豆乳的制備。按照“1.2.2”制得的全豆豆漿殺菌條件：115 ℃，15 min。冷卻至40 ℃，按照1∶1比例接種納豆芽孢桿菌和乳酸菌，37 ℃搖床發酵12 h，搖床轉速100 r/min，37 ℃靜置發酵8 h，冷藏后熟得到成品。

1.2.4菌落計數方法。納豆菌數量依照GB 4789.2食品微生物檢驗菌落總數測定[7]，乳酸菌數量依照GB 4789.35測定[8]。

1.2.5納豆激酶活力的測定。纖維蛋白平板法，參照并改良Astrup法制備雙層纖維蛋白平板[9]，下層為2.5%的瓊脂，上層為一支纖維蛋白原。先溶于3 mL 37 ℃無菌水中，再溶于20 mL已滅菌的巴比妥納緩沖液中；另取0.6 g瓊脂糖溶于40 mL巴比妥納緩沖液中滅菌冷卻至60 ℃，二者迅速混勻，加入人凝血酶300 μL(20 U/mL)，搖勻倒入4個Φ 9 mm已凝固的瓊脂平板上層，靜置1 h，用3 mm打孔器打孔，將尿激酶標準品(20、40、60、80、100、120、140、160 U/mL)各7 μL點樣于新配制的纖維蛋白平板上，放置10 min，移入37 ℃培養箱，保溫17 h后取出測定溶栓圈的垂直直徑，并以垂直直徑乘積(cm2)為橫坐標，以尿激酶濃度(U/mL)為縱坐標作圖，得標準曲線。

測定時取納豆激酶樣品用巴比妥納緩沖液稀釋至適當濃度，取7 μL點樣于纖維蛋白平板上，并以80 U/mL尿激酶作為標準對照，測量其形成透明圈2條相互垂直的直徑，并計算其面積，據標準曲線計算樣品活力Y值(U/mL)。其中樣品的X值=樣品溶栓圈直徑乘積(cm2)/校正系數f；f=樣品平板尿激酶對照溶栓圈直徑乘積(cm2)/標準曲線中相對應的尿激酶溶栓圈直徑乘積(cm2)。

1.2.6pH的測定。采用酸度計直接測定。

1.2.7產品感官評價。由5名男生和5名女生組成感官鑒評小組，并接受感官鑒定培訓。小組成員要求對酸豆乳的表觀、氣味、風味和質地指標進行評價，感官審評評分標準見表1。

表1　感官評價評分標準

2結果與分析

當乳酸菌與納豆菌同時接種，靜置培養時，乳酸菌生產迅速，成為優勢菌落，產酸、消耗大量營養物質，使納豆菌無法快速生長。所以，納豆芽孢桿菌與乳酸菌共同發酵中，應使納豆菌先大量生長，可在接種納豆芽孢桿菌一段時間后再接種乳酸菌[10]，也可以在同時接種后，通過控制發酵條件，促進納豆芽孢桿菌生長[11]。

在同時接種后，進行搖床培養，增加培養基溶氧量，促進好氧的納豆菌快速生長，進而積累納豆激酶等發酵產物；在此發酵后期，改為靜置培養。發酵前期納豆芽孢桿菌的大量生長造成培養基的低溶氧狀態；同時乳酸菌水解蛋白質能力較弱，而納豆芽孢桿菌水解蛋白質的酶系較強，為乳酸菌提供了氮源。這些因素促進了乳酸菌的生長，從而產生了良好的風味。乳酸菌發酵產酸，乳酸、乙酸的積累，最終也會抑制納豆芽孢桿菌、乳酸菌的生長。同時，乳酸菌、納豆芽孢桿菌競爭營養物質，二者的關系復雜，希望篩選出一株能與納豆芽孢桿菌良好共生且能改善納豆不良風味的乳酸菌菌種。

2.1不同乳酸菌菌種對全豆納豆豆乳中納豆芽孢桿菌、乳酸菌數量的影響由表2可見，7個試驗組，只有L.l不能與納豆芽孢桿菌良好共生，在前期搖床培養時，乳酸菌活菌數顯著下降，后期靜置培養時，乳酸菌活菌數略有上升；其余6個試驗組中，乳酸菌與納豆菌都能在豆漿體系中良好共生。L.p和S為植物乳桿菌，發酵所得的豆乳中乳酸菌活菌數較高，分別為(9.24±0.13) lg(CFU/mL)、(9.97±0.04 )lg(CFU/mL)，這可能是因為植物乳桿菌能夠利用的碳源種類較多。此外，3種商業菌種發酵的豆乳中乳酸菌活菌數較高。

2.2不同試驗組的納豆激酶酶活變化

2.2.1尿激酶標準曲線。圖1為尿激酶的標準曲線，以垂直直徑乘積為橫坐標，尿激酶活性為縱坐標，標準曲線方程y=-55.250 78+1.232 98x,R2=0.992 8。

2.2.2納豆激酶酶活力的變化。由圖2可見，L.l試驗組納豆激酶活力最高，這與“2.1”中活菌數的結果相吻合，該試驗組乳酸菌生長受抑制，納豆芽孢桿菌獲得營養物質充足，生長旺盛，因而其代謝產物納豆激酶積累較多，酶活較高。

整個發酵過程中，除L.l，其余6個試驗組的納豆激酶酶活均呈現先上升后下降趨勢。在發酵前期，納豆芽孢桿菌大量生長，積累代謝產物，納豆激酶酶活上升；而在后期，乳酸菌生長加快，與納豆菌競爭營養物質，同時體系的pH快速下降，混合發酵豆乳中的納豆激酶酶活下降。發酵結束時，混合發酵豆乳中納豆激酶酶活從高到低依次為L.l、H、S、L.p、S.t+L.d、L.a、D，分別為388.8、300.8、282.0、264.0、235.5、215.2、200.0 U/mL。

2.3不同乳酸菌菌種對全豆酸豆乳pH的影響由圖3可見，L.p、L.l、S這3個試驗組，在發酵前期，豆乳的pH先上升，主要原因是，前期納豆芽孢桿菌大量生長，占據優勢地位，并水解大豆蛋白產生氨基酸以及肽段；發酵后期，豆乳的pH下降，是由于乳酸菌大量生長，產生乳酸，這又抑制了納豆芽孢桿菌的生長。

表2　乳酸菌和納豆菌活菌數的變化

圖1　尿激酶標準曲線Fig.1　Standard curve of uokinase

圖2　發酵豆乳中納豆激酶酶活性的變化Fig.2　Change of the activity of nattokinase in fermented soymilk

S.t+L.d、L.a、D、H 4個試驗組在發酵的過程中，pH整體呈下降趨勢，發酵初期下降較慢，發酵后期下降較快，整體呈下降趨勢。這是因為這4個試驗組乳酸菌在發酵豆乳體系中生長良好，同時產酸能力較強。前期pH下降速度較慢的原因是，納豆芽孢桿菌水解大豆蛋白產生了氨基酸、肽段，這對于pH的下降有延緩作用。

發酵結束時，各個試驗組所得的發酵豆乳的pH由高到低依次為L.l、L.p、D、S、S.t+L.d、H、L.a，分別為6.39、4.88、4.67、4.63、4.45、4.27、4.17。

圖3　發酵豆乳中pH的變化Fig.3　Change of pH value in fermented soymilk

2.4不同乳酸菌菌種對全豆酸豆乳感官評分的影響根據制定的評分表進行感官評定，結果如表3所示。利用納豆芽孢桿菌與乳酸菌共同發酵，利用乳酸菌發酵產酸產香的特性，改善納豆芽孢桿菌單獨發酵產生的不良風味。因而，感官品質是菌種篩選時考慮的重要指標之一。

表3　發酵豆乳的感官評分

注：右上角標的小寫英文字母表示每一列數值之間的差異顯著性(P<0.05)。

Note：Difference among lowercase letters in same column:P<0.05.

由表3可見 ，L.l組香氣、滋味、總體接受程度評分均為最低，這是因為乳酸乳球菌乳亞種在混合發酵豆乳體系中生長不旺盛，因而代謝產物較少，對混合發酵豆乳風味改善作用弱。除了L.l試驗組，各組的色澤評分沒有顯著差異。S.t+L.d試驗組，組織狀態評分顯著低于除了L.l的5組。已有報道指出，發酵豆乳中蛋白質的等電點在pH 4.5左右[12]。發酵豆乳的最佳pH在4.2～4.3[13]。S.t+L.d試驗組發酵結束時pH為4.45，與4.5很接近，蛋白質體系不穩定對發酵豆乳的質構產生不良影響。S、D、H 3個試驗組所用的乳酸菌均為商業菌種，發酵豆乳的香氣、滋味、總體接受程度都較高，其中H試驗組的感官總體接受程度最高。

3結論

該試驗利用不同乳酸菌與納豆芽孢桿菌共同發酵，制作全豆豆乳，考察了各試驗組在發酵過程中活菌數、酶活、pH的變化規律并對發酵豆乳的感官質量進行評分。試驗表明，H組漢森商業乳酸菌菌種能與納豆芽孢桿菌一起在豆乳體系中良好生長，所得發酵豆乳感官評分總體接受度最高，納豆激酶酶活最高。綜合各項指標，選用漢森商業乳酸菌作為與納豆芽孢桿菌共同發酵豆乳的乳酸菌菌種。

參考文獻

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作者簡介武旭(1991- )，女，江蘇連云港人，碩士研究生，研究方向：食品資源綜合利用。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事食品安全研究。

收稿日期2016-03-30

中圖分類號TS 214

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-065-04

Improvement of the Quality of the Soybean Milk Fermented withBacillusnattothrough the Inoculation of Different Lactobacillus Strains

WU Xu, QIAN He*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

Abstract[Objective] The quality of soybean milk fermented with Bacillus natto was improved through the experiment. [Method] The Bacillus natto and different lactobacillus strains were used to ferment whole soybean milk.The change of microbial counts, activity of nattokinas, pH and sensory scores during its fermentation process was studied. [Result] The experimental result showed that the Hansen commercial lactobacillus and Bacillus natto, which were used in the soybean milk fermentation, could grow well.Both the sensory score of the fermented soymilk and the activity of enzyme and natto were highest. [Conclusion] The flavor of natto products is improved and the reference for soybean processing was provided.

Key wordsFermented soymilk; Co-fermentation; Lactobacillus; Bacillus natto; Nattokinase