HPLC法檢測光枝勾兒茶內蘆丁和槲皮素方法的建立

武玉祥，王小平，王 虹，秦華軍，萬合峰，賈 強*

(1.貴州科學院貝科生物資源研究開發中心，貴州貴陽 550009；2.貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009；3.黔東南民族職業技術學院，貴州凱里 556000)

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HPLC法檢測光枝勾兒茶內蘆丁和槲皮素方法的建立

武玉祥1，2，王小平3，王 虹2，秦華軍1，2，萬合峰1，2，賈 強1，2*

(1.貴州科學院貝科生物資源研究開發中心，貴州貴陽 550009；2.貴州省生物研究所，貴州貴陽 550009；3.黔東南民族職業技術學院，貴州凱里 556000)

摘要[目的]建立一種同時測定光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素的含量的方法。[方法]采用HPLC法對光枝勾兒茶內的蘆丁和槲皮素進行測定，色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1 %磷酸水溶液，檢測波長360 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃；進樣量10 μL。[結果]蘆丁和槲皮素分別在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。蘆丁平均回收率為98.84%，RSD為2.34%；槲皮素平均回收率為99.65%，RSD為2.51%。[結論]該方法簡便、準確、精密度高、重復性好，可用于該藥材的質量檢測。

關鍵詞光枝勾兒茶；蘆丁；槲皮素；HPLC法；含量

目前，市場上治療豬、牛、羊腹瀉的主要藥物是抗生素類，抗生素使用后在動物體內存在殘留和抗藥性問題，食用后影響人體健康。中獸藥能有效避免藥物殘留和抗藥性的問題，成為目前研究的熱點[1]，如止痢散，其主要成分是光枝勾兒茶[2]。光枝勾兒茶(BerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson)是鼠李科勾兒茶屬的一個變種，具有清熱利濕、止咳等功效[3]，同時可治療豬、牛、羊的腹瀉[4-8]。

中獸藥進入市場前需對藥物的質量標準進行檢測，為此需對止痢散藥效進行檢測。研究發現，止痢散主要藥效源于光之勾兒茶內的黃酮類化合物蘆丁和槲皮素[9]，測定蘆丁和槲皮素的主要方法有分光光度法和HPLC法[10-11]。檢測光枝勾兒茶中蘆丁和槲皮素報道較少且一般均分開檢測這2種物質[12-13]，忽略了兩者在一起的藥效作用，對評價光之勾兒茶內蘆丁和槲皮素的聯合藥效不夠精確，該研究采用HPLC法同時測定光枝勾兒茶內蘆丁和槲皮素的含量，以期為評價光枝勾兒茶藥效提供依據。

1材料與方法

1.1儀器Agilent 1263LC色譜儀(美國Agilent公司)；SB2200型超聲波清洗機(上海卓越儀器有限公司)；AE200電子天平(中國梅特勒托利多公司)；優普超純水機(成都優普儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(天津泰斯特儀器公司)；98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；SHB-循環水式多真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；旋轉蒸發器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試料光枝勾兒茶采自貴州省貴陽修文、安順鎮寧、興義貞豐、安順關嶺、安順紫云、廣西桂林、四川成都、黔東南丹寨、畢節納雍、銅仁德江等不同地區，每個地區均采集根、藤、葉。蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所，批號10080-200707，含量90.5%；槲皮素對照品購于中國生物制品檢定所，批號10081-200406，含量97.3%。乙腈為色譜純；其他試劑為分析純；水為去離子水。

1.3方法

1.3.1溶液的配置。

1.3.1.1對照品溶液的制備。精密稱取真空干燥蘆丁對照品10.9 mg，用甲醇使其充分溶解，定容至10 mL，得質量濃度為0.109 mg/mL，備用。精密稱取真空干燥槲皮素對照品10.4 mg，用甲醇使其充分溶解，并定容至10 mL，得質量濃度為0.104 mg/mL，備用。

1.3.1.2供試品溶液的制備。準確稱取光枝勾兒茶粉末10.00 mg，用100 mL甲醇回流提取3次，每次提取1 h，過濾，合并濾液，濾液揮發干燥，用甲醇定容至100 mL，再用0.45 μm濾膜過濾，濾液作為供試品備用。

1.3.2方法學考察。

1.3.2.1色譜條件及系統適應性試驗。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-磷酸水溶液，流速1.0 mL/min，柱溫28 ℃，進樣量10 μL，檢測波長360 nm。在選定條件下，蘆丁、槲皮素色譜峰與其他雜質峰達到基線分離，分離度(R)>1.5，蘆丁、槲皮素踏板數>3 000。

1.3.2.2標準曲線的繪制。

(1)蘆丁標準曲線的繪制。精密吸取質量濃度為0.109 mg/mL的蘆丁對照品供試液1、2、4、6、8、10 μL進樣，按照“1.3.2.1”色譜條件進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

(2)槲皮素標準曲線的繪制。精密吸取質量濃度為0.104 mg/mL的槲皮素對照品供試液1、2、4、6、8、10 μL進樣，按照“1.3.2.1”色譜條件進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標、質量濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.3.2.3精密度試驗。取對照品溶液10 μL，分別連續進樣5次，每次10 μL，以峰面積計算精密度，要求RSD<3%。

1.3.2.4重復性試驗。精密稱取光枝勾兒茶藥材6份樣品，按“1.3.1.2”方法操作，每份進樣5次，每次10 μL，要求蘆丁、槲皮素的RSD<3%。

1.3.2.5穩定性試驗。取對照品、供試品各1份，室溫下分別放置0、2、4、12、24、48 h后，測定峰面積。

1.3.2.6加樣回收率試驗。根據線性范圍設計蘆丁和槲皮素含量高、中、低3種水平，精密吸取已測知蘆丁和槲皮素含量的光枝勾兒茶藥材適量，每個水平3份，再分別按要求精密加入一定量的對照品，按“1.3.1.2”方法操作，用HPLC方法測定，計算回收率。

1.3.3樣品中蘆丁、槲皮素含量的測定。過0.45 μm濾膜后，按照“1.3.2.1”色譜條件和“1.3.1.2”供試品溶液配制方法測定蘆丁和槲皮素的含量。

2結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1系統適應性試驗。由圖1可見，在6.105 min，蘆丁對照品出現最大吸收峰，主峰尖銳且無雜峰；槲皮素對照品在19.375 min出現最大吸收峰，主峰尖銳無雜峰。樣品中蘆丁和槲皮素的最大吸收峰主峰尖銳無雜峰，最大吸收峰出現的時間分別在6.069和19.206 min，與對照品最大吸收峰時間十分接近。

圖1　蘆丁對照品(a)、槲皮素對照品(b)和安順紫云樣品(c)HPLC圖譜Fig. 1　HPLC value of rutin(a), quercetin(b) and Anshun Ziyun sample(c)

2.1.2標準曲線的繪制。按照“1.3.2.1”方法操作，得到蘆丁和槲皮素的回歸曲線分別為Y=269.9X+9.689 9(r=0.999 5)、Y=818.71X(r=0.999 9)，表明蘆丁和槲皮素的濃度分別在0.109～1.090、0.104～1.040 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.1.3精密度試驗。按照“1.3.2.3”方法操作，得到蘆丁和槲皮素RSD分別為0.32%、0.29%(n=5)，表明操作過程中儀器精密度良好。

2.1.4重復性試驗。按照“1.3.2.4”方法操作，得到蘆丁、槲皮素RSD分別為2.48%、2.94%，表明方法具有較好的重復性。

2.1.5穩定性試驗。按照“1.3.2.5”方法，得到蘆丁和槲皮素的峰面積RSD分別為1.86%、2.87%，表明樣品供試液在48 h內穩定。

2.1.6加樣回收率試驗。由表1可見，蘆丁平均回收率為98.84%，RSD值為2.34%，槲皮素平均回收率為99.65%，RSD值為2.51%，表明加樣回收率均符合要求。

2.2樣品中蘆丁、槲皮素含量的測定分別對采集于我國不同地區的10個光之勾兒茶樣品內的蘆丁和槲皮素進行同時測定，結果發現(表2)，黔東南丹寨的光之勾兒茶內蘆丁、槲皮素含量最高。

3討論與結論

該試驗在制備供試品溶液時分別采用50%、95%的乙醇、無水乙醇、甲醇作為溶劑，經過HPLC試驗分析，得出甲醇溶解所得的供試品峰形、分離度均好。因此，選取甲醇為提取液。預試驗分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈- 水、乙腈-0.1%磷酸為流動相系統，通過出峰數目、峰面積、分離度等的對比，選擇最優的流動相為乙腈-0.1%磷酸，在此流動相系統時出峰的數目多，分離效果好，漂移現象弱，峰形好。在預試驗過程中分別選用280、354、360 nm，其中蘆丁最大吸收波長分別為280、360 nm，槲皮素吸收最大波長分別為254、360 nm，兼顧蘆丁、槲皮素檢測靈敏度，確定最佳檢測波長為360 nm。蘆丁和槲皮素在360 nm處有最大的紫外吸收值。

該研究采用HPLC法同時測定光枝勾兒茶內蘆丁和槲皮素的含量，結果發現，蘆丁和槲皮素分別在0.109～1.090和0.104～1.040 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系；蘆丁平均回收率為98.84%，RSD為2.34%；槲皮素平均回收率為99.65%，RSD為2.51%。該方法簡便、準確、精密度高、重復性好，可用于該藥材的質量檢測，為光枝勾兒茶質量標準提供重要的方法依據。

表1　加樣回收率試驗結果

表2　樣品中蘆丁及槲皮素含量測定結果

參考文獻

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基金項目貴州省科技廳重大專項[黔科合重大專項(2013)6041]。

作者簡介武玉祥(1985- )，男，山東臨沂人，研究實習員，碩士，從事微生物學與分子生物學研究。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導師，從事生物資源開發與利用研究。

收稿日期2016-03-23

中圖分類號R 284

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-164-03

Establishment of the Testing Method of Rutin and Quercetin inBerchemiapolyphyllaWall.ex.Lawson with HPLC

WU Yu-xiang1,2， WANG Xiao-ping3，WANG Hong2, JIA Qiang1,2*et al

(1.Academy of Sciences Beike Biological Resource Research and Development Center，Guiyang，Guizhou 550009；2.Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou 550009；3.Qiandongnan National Vocational and Technical College, Kaili，Guizhou 556000)

Abstract[Objective] The determination method of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was established at same time. [Method]The contain of rutin and quercetin in Berchemia polyphylla Wall was tested with HPLC method, in which, the column was ZORBAX SB-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); the mobile phase of acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution; the detection wavelength, 360 nm; the flow rate, 1.0 mL / min; the column temperature, 25 ℃ and the injection volume, 10 μL. [Result] There was good linear relationship between the content of rutin and quercetin and the value of testing peak area when the contain of rutin and quercetinin was in the range of 0.109～1.090 and 0.104-1.040 μg respectively. Average recovery ratio of rutin was 98.84% and RSD was 2.34%; average recovery ratio of quercetin was 99.65% and RSD 2.51%. [Conclusion] The method is simple, accurate, high precision and good repeatability that could be used in the measurement of the Chinese medicine quality.

Key wordsBerchemia polyphylla Wall；Rutin；Quercetin；HPLC；Content