琥乙紅霉素納米乳的制備及其體外抑菌活性研究

鄭星星，歐陽(yáng)五慶

(1.榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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琥乙紅霉素納米乳的制備及其體外抑菌活性研究

鄭星星1，歐陽(yáng)五慶2

(1.榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校，陜西榆林 719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

摘要[目的]制備琥乙紅霉素納米乳，并對(duì)其進(jìn)行體外抑菌活性研究。[方法]利用偽三元相圖法篩選琥乙紅霉素納米乳處方；采用微量肉湯稀釋法，檢測(cè)琥乙紅霉素納米乳對(duì)致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌和變形桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)。[結(jié)果]琥乙紅霉素納米乳中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如下：琥乙紅霉素2.8%、乳酸甲氧芐啶 0.6%、EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸餾水 53.9%。體外抑菌試驗(yàn)表明，琥乙紅霉素納米乳對(duì)致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌和變形桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為4、1、2和4 μg/mL，其抑菌效果明顯優(yōu)于其他對(duì)照藥物組。[結(jié)論]該研究成功研制了琥乙紅霉素納米乳，其體外抑菌效果明顯。

關(guān)鍵詞頭孢克肟；納米乳；偽三元相圖；最小抑菌濃度

琥乙紅霉素，英文名Erythromycin，屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為紅霉素的琥珀酸乙酯，在胃酸中較紅霉素穩(wěn)定。對(duì)葡萄球菌屬( 耐甲氧西林菌株除外 )、各組鏈球菌和革蘭陽(yáng)性桿菌均具有抗菌活性。奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌和百日咳鮑特氏菌等也對(duì)本品敏感[1]。本品對(duì)除脆弱擬桿菌和梭桿菌屬以外的各種厭氧菌亦具有抗菌作用，對(duì)軍團(tuán)菌屬、胎兒彎曲菌、某些螺旋體、肺炎支原體、立克次體屬和衣原體屬也有抑制作用。本品可透過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜，在接近供位(P位)與細(xì)菌核糖體的 50S亞基形成可逆性結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)移核糖核酸(t-RNA)結(jié)合至 “P” 位上，同時(shí)也阻斷多肽鏈自受位(“A” 位)至 “P” 位的位移，從而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成[2]。本品為含矯味劑的顆粒，味甜而芳香。乳酸甲氧芐啶是許多抗生素通用的增效劑，與琥乙紅霉素合用時(shí)能大大提高其抗菌活性。

納米乳(Nanoemulsion)也稱為微乳(Microemulsion)，粒徑一般為1～100nm，是由油相、水相和表面活性劑按適當(dāng)比例混合而成的一種透明或半透明、低黏度的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定體系[3]。納米乳作為藥物載體，具有以下優(yōu)點(diǎn)：提高難溶性藥物的溶解度，增強(qiáng)不穩(wěn)定藥物的穩(wěn)定性，黏度低、粒徑小且均勻，使被包容的藥物分散度提高，具有緩釋和靶向作用，促進(jìn)藥物在體內(nèi)的吸收，提高其生物利用度，降低其毒副作用[4]。筆者根據(jù)琥乙紅霉素的理化性質(zhì)將其制成納米乳，并考察其體外抑菌效果，以期為該納米乳藥物在人類和獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑和藥品。琥乙紅霉素，購(gòu)自湖北恒碩化工有限公司，純度99%；肉桂醛，購(gòu)自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；肉豆蔻酸異丙酯，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三乙酸甘油酯，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、EL-40、RH-40均為化學(xué)純，購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；琥乙紅霉素片，批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H37020815，購(gòu)自山東仁和堂藥業(yè)有限公司；琥乙紅霉素顆粒，批號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H6102171，購(gòu)自西安利君制藥有限責(zé)任公司。

1.1.2菌株。①臨床菌株。致病性大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、變形桿菌，由榆林農(nóng)業(yè)學(xué)校獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。②質(zhì)控菌株。大腸埃希氏菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.3主要儀器。DS224S電子天平，為德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；SKP02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，為黃山市恒豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2琥乙紅霉素納米乳的制備

1.2.1油相的確定。將琥乙紅霉素溶于油脂中，作為油相部分，測(cè)定琥乙紅霉素在常用的油相肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度，選擇溶解度最大的作為油相。將乳酸甲氧芐啶加入到蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，作為水相。

1.2.2表面活性劑的確定。油相確定后，選擇3種常見的非離子型表面活性劑吐溫-80、EL-40、RH-40，分別與“1.2.1”中篩選出的油相按質(zhì)量比9.8∶0.2、9.5∶0.5、9∶1、8.75∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混勻，邊攪拌邊逐滴加入水相，直至形成透明、澄清的乳液。記錄當(dāng)體系由黏稠突然變稀時(shí)的臨界加水相量，并計(jì)算體系中各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別以表面活性劑、油相、水相作為相圖的3個(gè)頂點(diǎn)，使用OriginPro8.0軟件繪制偽三元相圖，根據(jù)納米乳區(qū)域面積的大小篩選出最佳表面活性劑[5-6]。

1.2.3琥乙紅霉素納米乳的制備。根據(jù)上述篩選的油相和表面活性劑，確定琥乙紅霉素納米乳的配方。在室溫下，將所述的琥乙紅霉素溶于油中，再加入表面活性劑混合均勻，最后一邊攪拌一邊滴加適量的水相，即可制備出澄清透明的琥乙紅霉素納米乳。

1.3琥乙紅霉素納米乳體外抑菌活性的測(cè)定采用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLs)制定的微量肉湯稀釋法[7]，檢測(cè)琥乙紅霉素納米乳對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、變形桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)，試驗(yàn)設(shè)置琥乙紅霉素納米乳組、琥乙紅霉素顆粒組、琥乙紅霉素片組。制備各受試抗菌藥物溶液質(zhì)量濃度為2 560μg/mL，然后進(jìn)行倍比稀釋成一系列濃度梯度，使藥物質(zhì)量濃度為0.25～128.00μg/mL，過(guò)濾除菌后于4 ℃下保存?zhèn)溆?。將生長(zhǎng)后的菌液用生理鹽水校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋濃度成105～106個(gè)/mL，備用。將96孔平底U型微量板在紫外燈滅菌30min后，在每排第1孔至第10孔按照高濃度至低濃度分別加入受試藥液各100μL，第11孔不添加菌液(只添加200μL藥液)作為藥物對(duì)照，第12孔只添加200μL菌液作為菌液對(duì)照。分別吸取100μL稀釋好的菌液，加入第1～10孔內(nèi)。將微孔板置于微型振蕩器上振蕩1min，使各孔內(nèi)溶液混勻，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)，35～37 ℃下孵育16～20h后進(jìn)行觀察。肉眼觀察各孔，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)藥液的最低質(zhì)量濃度為MIC。試驗(yàn)所用質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922，CLSI推薦的琥乙紅霉素的MIC參考值為1～8μg/mL，只有當(dāng)琥乙紅霉素對(duì)質(zhì)控菌的MIC值處于該范圍，才可接受試驗(yàn)結(jié)果，否則該批數(shù)據(jù)作廢，找出原因后進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。將所有完全清晰無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)液，分別接種于不含抗菌藥物的瓊脂平板中，最低藥物質(zhì)量濃度即為該藥物的MBC。所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1琥乙紅霉素納米乳配方的確定及制備

2.1.1油相的確定。琥乙紅霉素在IPM、肉桂醛、三乙酸甘油酯中的溶解度分別為0.05、0.28和0.16g/mL，考慮到納米乳的載藥量，最后確定油相為肉桂醛。

2.1.2表面活性劑的確定。從圖1可以看出，3種表面活性劑形成的納米乳區(qū)域從大到小依序?yàn)镋L-40、吐溫-80、RH-40。因此，選擇EL-40作為本體系的表面活性劑。

注；圖中陰影部分為納米乳區(qū)。Note：The shaded area was nanoemulsion region.圖1　不同表面活性劑對(duì)琥乙紅霉素納米乳形成區(qū)域的影響Fig.1　Effects of surfacants on erythromycin nanoemulsion region

2.1.3琥乙紅霉素納米乳配方的確定。琥乙紅霉素納米乳中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)如下：琥乙紅霉素2.8%、乳酸甲氧芐啶 0.6%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸餾水 53.9%。

2.2琥乙紅霉素納米乳的體外抑菌活性試驗(yàn)中質(zhì)控菌株結(jié)果穩(wěn)定，琥乙紅霉素對(duì)質(zhì)控菌株的MIC值在CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，而且菌液對(duì)照孔中菌株生長(zhǎng)狀況良好，說(shuō)明此次試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)可靠。從表1可以看出，琥乙紅霉素納米乳的體外抑菌效果明顯優(yōu)于琥乙紅霉素顆粒和琥乙紅霉素片，值得在臨床上進(jìn)行推廣應(yīng)用。

3討論與結(jié)論

納米乳是一種極具開發(fā)前途的新型藥物載體，近年來(lái)已在生物醫(yī)藥、食品、日用化工、有機(jī)合成等領(lǐng)域開展了廣泛的研究應(yīng)用。納米乳作為藥物載體，具有其他藥物載體所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)[8-9]：①穩(wěn)定性好；②能提高藥物的載藥量；③大大促進(jìn)在體內(nèi)的吸收[10]；④具有緩釋和靶向作用[11]；⑤給藥途徑多樣。納米乳配方設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格，不僅要求能夠在較大配方范圍內(nèi)形成穩(wěn)定的納米乳，而且要符合納米乳作為藥物載體的特殊要求，如無(wú)毒、無(wú)刺激、無(wú)不良作用，具有良好的生物相容性。同時(shí)，要求納米乳既能夠增加藥物的溶解能力，又不能影響藥物的藥效和穩(wěn)定性。

為了提高藥物在油相中溶解度，增大納米乳形成區(qū)域，應(yīng)盡可能選擇溶解度大且無(wú)毒無(wú)刺激的短鏈油相，筆者通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)琥乙紅霉素在肉桂醛中的溶解度最大；在選擇表面活性劑時(shí)，通過(guò)繪制偽三元相圖發(fā)現(xiàn)EL-40作為表面活性劑時(shí)形成的乳區(qū)最大；經(jīng)過(guò)篩選確定的琥乙紅霉素納米乳各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：琥乙紅霉素2.8%、乳酸甲氧芐啶 0.6%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸餾水 53.9%。篩選發(fā)現(xiàn)琥乙紅霉素在肉桂醛中的溶解度最大；在選擇表面活性劑時(shí)，通過(guò)繪制偽三元相圖發(fā)現(xiàn)EL-40作為表面活性劑時(shí)形成的乳區(qū)最大；經(jīng)過(guò)篩選確定的琥乙紅霉素納米乳各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：琥乙紅霉素2.8%、乳酸甲氧芐啶 0.6%，EL-40 35.2%、肉桂醛7.5%、蒸餾水 53.9%。

表1　琥乙紅霉素納米乳的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

該研究不僅成功研制了琥乙紅霉素納米乳，并對(duì)其體外抑菌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明琥乙紅霉素納米乳對(duì)致病性大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌和變形桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為4、1、2和4μg/mL，其抑菌效果明顯優(yōu)于琥乙紅霉素顆粒和琥乙紅霉素片組。究其原因，可能是因?yàn)殓壹t霉素納米乳粒徑很小，特別容易附著在細(xì)菌上，具有很強(qiáng)的穿透力，能夠更好地穿過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞壁從而起到殺菌作用；此外，納米乳制劑發(fā)揮了一定的緩釋作用，從而延長(zhǎng)了藥物的有效殺菌濃度和時(shí)間，增強(qiáng)了殺菌效果[12]，因此值得進(jìn)行進(jìn)一步研究和在臨床上推廣應(yīng)用。

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基金項(xiàng)目陜西省重大科技創(chuàng)新專項(xiàng)(K332020916)。

作者簡(jiǎn)介鄭星星(1987- )，女，陜西榆林人，助教，碩士，從事畜牧獸醫(yī)教學(xué)與研究。

收稿日期2016-04-03

中圖分類號(hào)S 859.5+3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)13-183-03

PreparationofErythromycinNanoemulsionandDeterminationofItsBacteriostaticActivityin vitro

ZHENGXing-xing1,OUYANGWu-qing2

(1.YulinAgriculturalSchool,Yulin,Shaanxi719000; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100)

Abstract[Objective] To prepare erythromycin nanoemulsion, and to research its bacteriostatic activity in vitro. [Method] The preparation of the erythromycin nanoemulsion was optimized by studying the pseudoternary phase diagram. Broth dilution method was used to determine the MIC and MBC of erythromycin nanoemulsion on enteropathogenic Escherichia coli, Staphylococcus aureus, pneumococcus and proteus. [Result] The mass fraction of the components in erythromycin nanoemulsion included 2.8% rythromycin, 0.6% trimethoprim lactate, 35.2% EL-40, 7.5% cinnamaldehyde, and 53.9% distilled water. The susceptibility test revealed that the MIC of erythromycin nanoemulsion on enteropathogenic E. coli, S. aureus, pneumococcus and proteus was 4, 1, 2 and 4 μg /mL, respectively. Their antibacterial effects significantly was better than other drugs. [Conclusion]The erythromycin nanoemulsion is successfully prepared, and its antibacterial effect in vitro is remarkable.

Key wordsCefixime; Nanoemulsion; Pseudoternary phase diagram; Minimum inhibitory concentration