超敏蛋白誘導水稻對立枯病的抗性

李文學， 李海燕， 蔡德利， 商瑩宇， 陳天宇

(黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319)

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超敏蛋白誘導水稻對立枯病的抗性

李文學， 李海燕*， 蔡德利， 商瑩宇， 陳天宇

(黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319)

摘要[目的]明確超敏蛋白對水稻立枯病的誘抗作用。[方法]以龍粳37水稻品種為試驗材料，研究不同濃度超敏蛋白浸種處理對水稻生長發育的影響，測定超敏蛋白處理后水稻苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)含量變化。[結果]不同濃度超敏蛋白對水稻生長發育均有促進作用，且與對照相比不同濃度超敏蛋白處理水稻均不同程度地誘導了水稻防御酶PAL、POD和PPO活性，以稀釋20倍的超敏蛋白誘導能力最強。[結論]研究結果為超敏蛋白抗病機理研究提供了理論依據。

關鍵詞超敏蛋白；水稻立枯??；防御酶；抗病性

水稻立枯病是水稻旱育苗的主要病害，主要因低溫多濕、土壤偏堿、溫差大、播種量過大、光照不足、秧苗細弱等多種因素所致。近些年來，隨著水稻種植面積的擴大，該病在旱育秧田中發生普遍，輕者成團發生，重者幼苗全部死亡，嚴重影響了水稻秧苗素質和水稻產量。種子處理是防治秧田立枯病的有效方法之一，但近年來部分病菌對殺菌劑已經產生抗藥性，而藥劑又會污染環境，同時也會對有益微生物產生威脅[1]。誘導劑具有誘導抗性的廣泛性，通過誘導植物自身產生抗性從而有利于保護植物和土壤中的有益微生物[2]。

超敏蛋白是從梨火疫病菌(Erwinina amylovora)中分離出來的[3]。據報道，超敏蛋白對60種以上病害都具有不同程度的抗病作用[4-7]，對番茄葉霉病誘抗效果達70.10%，對辣椒病毒病誘抗效果最高達96.90%，對油菜菌核病的誘抗防效最高達73.69%，可減輕小麥蚜蟲危害達84.9%，減輕二化螟對水稻危害43%左右。目前，關于超敏蛋白用于浸種處理對水稻病害的誘抗效果的研究鮮見報道。鑒于此，筆者以龍粳37為試驗材料,探討了超敏蛋白對水稻苗期病害的誘導抗性效果，以期為生產實踐提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料供試品種：龍粳37。供試藥劑：超敏蛋白，由黑龍江八一農墾大學食品學院郭德軍老師提供。供試病原菌：立枯絲核菌、鐮刀菌，由黑龍江八一農墾大學植物免疫室分離。

1.2方法

1.2.1超敏蛋白浸種對水稻生長發育的影響。將超敏蛋白設置為3個濃度梯度，分別為原液、稀釋20倍、稀釋40倍，同時設清水對照，共4個處理。稱取100.0g種子，分別用上述濃度超敏蛋白對水稻種子進行浸種處理7d，數取100粒種子放于培養皿中，置于25 ℃生化培養箱內進行發芽試驗，每個處理3次重復，測定超敏蛋白對水稻幼苗生長的影響。

1.2.2超敏蛋白的誘抗作用。試驗處理同“1.2.1”。浸種催芽后進行室內盆栽試驗，盆栽用田徑高壓滅菌后，定量上述供試立枯病病原菌，在水稻生長3葉期時，調查各處理立枯病的發病率，并取樣測定相關的酶活性。

1.2.2.1粗酶液的提取。稱取1.0g樣本，放入預冷的研缽中，加入2.00mL0.2mol/L硼酸緩沖液和0.4g石英砂，于冰浴中研磨成漿，將提取液轉入離心管中，12 000r/min、4 ℃離心20min。上清液即為粗酶液，將其放入冰箱中冷凍保存，測定酶活性。

1.2.2.2PAL活性的測定。參照薛應龍[8]的方法測定。在4.20mL反應體系中加入5.00mmol/L硼酸緩沖液(pH8.8)3.00mL、0.02mmol/L苯丙氨酸1.00mL、粗酶液0.20mL,在30 ℃水浴中反應30min，于冰浴中終止反應，以不加酶液為對照，在290nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD290增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

1.2.2.3POD活性的測定。參照朱廣廉[9]的方法測定。在3.00mL反應系統中加入50.00mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)2.97mL、20.00mmol/L愈創木酚50μL、粗酶液20μL、加入40.00mmol/LH2O220μL啟動反應，然后在17 ℃水浴中反應2min，以不加酶液為對照，在470nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD470增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

1.2.2.4PPO活性的測定。參照李靖等[10]的方法測定。在3.30mL反應體系中加入50.00mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)3.00mL、粗酶液100μL，加入100.00mmol/L的鄰苯二酚20μL啟動反應，30 ℃水浴反應2min，以不加酶液為對照，在398nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD398增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

2結果與分析

2.1超敏蛋白浸種對水稻幼苗生長的影響由表1可見，超敏蛋白浸種對水稻幼苗生長有明顯的促進作用，與對照相比，不同濃度處理下，根長增長了8.57%～20.00%；根條數增加了19.05%～26.19%；株高增長了16.31%～17.73%，為水稻壯苗提供了保障。

2.2超敏蛋白處理對水稻立枯病發病情況的影響由表2 可見，超敏蛋白不同處理后，水稻立枯病的發病率明顯降低，其中原液處理對立枯病的防治效果最好，稀釋不同倍數后仍有一定的效果，發病率分別下降了20.23%、19.48%和16.13%，表明超敏蛋白對水稻立枯病具有一定的誘導抗病性。

表1不同稀釋倍數的超敏蛋白對水稻幼苗生長的影響

Table1Effectofthedifferentdilutedconcentrationsofharpinonriceseedinggrowth

處理Treatment根長Rootlength∥cm根數Rootnumber∥條株高Plantheight∥cm原液Stocksolution3.85.016.6稀釋20倍Diluted20×4.25.316.6稀釋40倍Diluted40×4.25.016.4清水對照Cleanwatercontrol3.54.214.1

2.3超敏蛋白對PAL活性的影響PAL是苯丙烷類代謝的關鍵酶，苯丙烷代謝途徑酶類活性的增加和代謝產物含量的提高是植物對病原菌抵抗的普遍反應[11]。如圖1所示，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中PAL活性與對照組相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PAL酶活性分別提高了26.79%、23.95%和10.87%，說明超敏蛋白可誘導水稻中PAL酶活性，且在原液處理后酶活性達到高峰。

圖1　不同處理下植株體內PAL活性 Fig.1　The PAL activity of plant in different treatments

圖2　不同處理下植株體內POD活性Fig.2　The POD activity of plant in different treatments

2.4超敏蛋白對POD活性的影響POD是植物體內存在的一種氧化還原酶類，參與酚類氧化及木質素前體物質的聚合，能夠加速其代謝產物聚合為類木質素的反應進程，從而加固細胞壁，阻止病原菌的進一步擴展[11]。如圖2所示，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中POD活性與對照組相比均有所提高，分別是對照的1.008、1.026和1.015倍，不同濃度之間差異不大，超敏蛋白稀釋20倍對水稻POD酶活性的誘導效果最好。

圖3　不同濃度下植株體內PPO活性Fig.3　The PPO activity of plant in different treatments

2.5超敏蛋白對PPO活性的影響PPO的主要功能是在有氧條件下將多酚類物質氧化成對病原菌毒性更強的醌。激活蛋白誘導處理后PPO活性的升高有利于酚類物質的積累和醌的大量形成，增強對病原菌的抑制作用[11]。由圖3可見，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中PPO活性與對照組相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PPO活性分別提高了60.00%、67.60%和63.27%,表明

超敏蛋白稀釋20倍對水稻幼苗PPO活性的誘導效果最好。

3結論

該研究表明，超敏蛋白浸種處理水稻種子可促進秧苗生長和根系發育，并能有效控制水稻立枯病的發生。超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍的發病率均明顯低于對照組，發病率分別下降了20.00%、19.80%和16.40%。超敏蛋白處理可提高水稻幼苗中PAL、POD、PPO活性。其中超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PAL活性分別提高了26.79%、23.95%和10.87%，POD活性均有小幅度提升，PPO活性分別提高了60.00%、67.60%和63.27%。超敏蛋白處理水稻種子防治立枯病的作用可能源于其能夠誘導水稻幼苗抗性相關的防御酶系活性增強有關。綜合幼苗生長及防御酶系活性可見，超敏蛋白稀釋20倍時最佳。

參考文獻

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基金項目大學生創新創業訓練計劃項目A類創新訓練(XC2014004)。

作者簡介李文學(1992- )，男，甘肅白銀人，本科生，專業：植物保護。*通訊作者，教授，博士，從事植物病理學研究。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號S 435.111

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-186-02

TheInduced-resistanceofHarpinonRiceSeedlingBlight

LIWen-xue,LIHai-yan*,CAIDe-lietal

(HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing,Heilongjiang163319)

Abstract[Objective] To detect the induced-resistance of harpin on rice seedling blight. [Method] With Longjing 37 as the test materials, we researched the effects of seed soaking treatments in different harpin concentrations on the growth and development of rice. Content changes of PAL, PPO and POD were detected after harpin treatment. [Result] Different concentrations of harpin promoted rice growth, and the enzyme activities of PAL, PPO and POD in rice seeding were higher than those in the control. Diluted 20× harpin had the strongest induction ability in all treatments. [Conclusion] This research provides theoretical references for the research on harpin disease resistant mechanism.

Key wordsHarpin; Rice seedling blight; Defense enzyme; Disease resistance