上皮間質轉化與大腸癌奧沙利鉑化療耐藥的關系研究*

賈后軍,向　林

(重慶醫科大學附屬第一醫院:1.胃腸外科；2.臨床研究中心　400016)

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上皮間質轉化與大腸癌奧沙利鉑化療耐藥的關系研究*

賈后軍1,向林2

(重慶醫科大學附屬第一醫院:1.胃腸外科；2.臨床研究中心400016)

[摘要]目的上皮間質轉化(EMT)與大腸癌化療耐藥的關系。方法采用Transwell細胞遷移實驗及Transwell細胞侵襲實驗檢測大腸癌奧沙利鉑耐藥細胞株LOVO/L-OHP與大腸癌LOVO親本細胞遷移、侵襲能力，Western blot檢測LOVO與LOVO/L-OHP細胞株上皮細胞標志因子E-cadherin和間葉細胞標志因子Vimentin蛋白水平以評價EMT發生。然后用GSK-3β特異性抑制劑SB415286處理LOVO細胞誘導EMT，檢測各組細胞遷移、侵襲能力及E-cadherin和Vimentin蛋白表達評價表型改變，通過MTT法檢測細胞增殖，Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡以評價SB415286誘導EMT后對大腸癌細胞株奧沙利鉑化療敏感性的影響。結果耐藥細胞株LOVO/L-OHP形態學特點，Transwell細胞遷移侵襲實驗結果，E-cadherin和Vimentin蛋白表達改變證實LOVO/L-OHP出現了典型的EMT表型改變。增殖與凋亡結果提示SB415286誘導EMT后大腸癌細胞株的化療敏感性下降，導致大腸癌細胞化療耐藥。結論本研究從耐藥細胞株LOVO/L-OHP的EMT發生與誘導EMT對大腸癌細胞表型的改變和化療敏感性的影響兩個角度證實了EMT與大腸癌化療耐藥間的直接關系，從而為未來干預大腸癌化療耐藥性的治療奠定基礎并提供新的研究策略。

[關鍵詞]上皮間質轉化;大腸腫瘤;奧沙利鉑

隨著人們生活水平的提高、飲食習慣的改變、人口老齡化的影響，我國大腸癌患者數和死亡人數也逐年遞增。據統計，我國大腸癌每年新發病例已超過17萬，是發病率占世界第3位的惡性腫瘤，其病死率排第4位[1]。大腸癌的治療目前仍主要采取以手術、化療、放療為主的綜合治療，其中化療是大腸癌綜合治療的主要方法之一。新一代化療藥物(如奧沙利鉑、鹽酸伊立替康等)的應用在一定程度上提高了療效，降低了復發率，但仍有50%以上的進展期大腸癌治療失敗。化療耐藥性的產生是腫瘤治療失敗的關鍵因素，如何克服腫瘤細胞化療耐藥是目前亟待解決的問題。新近研究發現，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)不僅在多種上皮源性腫瘤的侵襲和轉移中起關鍵作用[2]，而且在一些腫瘤化療耐藥中可能起重要作用[3]。因此，本研究建立大腸癌奧沙利鉑(L-OHP)耐藥細胞株，比較耐藥細胞和親本細胞表型差異，同時觀察誘導EMT對大腸癌細胞表型的改變和化療敏感性的影響，以探討EMT與大腸癌化療耐藥間的關系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株大腸癌細胞株LOVO，購自中國科學院上海細胞生物所。奧沙利鉑耐藥大腸癌細胞株LOVO/L-OHP(前期實驗已建立)。

1.1.2主要儀器與試劑CO2細胞培養箱(Thermo Scientific FORMA 3111)，FACS Calibur流式細胞儀(BD)，凝膠成像分析系統(BIO-RAD GelDoc2000)，酶標儀(Thermo Scientific Multiskan Spectrum)，Matrigel基質膠/基質膜(BD)，RPMI-1640培養基(Hyclone)，胎牛血清(FBS)，0.25%胰酶溶液(索來寶)，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.1 moL/L,pH 7.4)，Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒，0.1%結晶紫染料溶液，Corning的Transwell小室；奧沙利鉑(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，上皮細胞標志因子E-cadherin和間葉細胞標志因子Vimentin單克隆抗體，GSK-3β特異性抑制劑SB415286(Biosource International公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測試劑盒(Sigma公司)，DMSO(Sigma公司)。羊抗鼠IgG二抗(北京博奧森)，PVDF膜(Millipore公司)，ECL化學發光試劑盒(上海貝博)。

1.2方法

1.2.1細胞培養大腸癌LOVO親本細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，100 mg/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液中，37 ℃，5% CO2、飽和濕度孵箱培養。每3天傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2耐藥細胞株形態學觀察和Transwell細胞遷移檢測在光鏡下觀察耐藥細胞株形態學上與其親本細胞株之間的差異，耐藥細胞株是否出現間葉細胞形態特點。Transwell細胞遷移實驗主要步驟：無菌條件下將遷移板拿出室溫下放置10 min，在上室加入300 μL預溫的無血清培養基，室溫下靜置15～30 min，水化。用含有0.5% FBS低血清培養基重懸大腸癌細胞、奧沙利鉑耐藥細胞株，調整濃度(1～5)×105cell/mL，上室加200 μL細胞懸液，下室中加入含有奧沙利鉑的細胞培養基500 μL，37 ℃孵育48 h。棉簽擦去上室上面的非遷移細胞，移去Transwells，倒置，風干，24孔板中加入500 μL含0.1%結晶紫染料，將小室置于其中，使膜浸沒在培養基中，37 ℃ 30 min后取出，PBS清洗。直徑上取5個視野進行計數。

1.2.3Transwell細胞侵襲檢測無菌條件下將Transwell小室拿出室溫下放置10 min。包被基底膜，上室每孔加入60～80 μL配置好的膠(剛好蓋住基底膜，冰上操作)。水化基底膜，每孔加入50 μL的0.5% FBS的培養基，37 ℃，30 min。用含有0.5% FBS低血清培養基重懸大腸癌細胞、奧沙利鉑耐藥細胞株，調整濃度(1～5)×105cell/mL，上室加200～300 μL細胞懸液，下室中加入含有奧沙利鉑的細胞培養基500 μL，37 ℃孵育48 h，染色和計數同遷移實驗方法。

1.2.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測每106細胞加裂解液200 μL，4 ℃，裂解30 min，離心取上清液測定蛋白水平，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別加抗E-cadherin (1∶300)、Vimentin(1∶200)及β-actin一抗(1∶500)，抗體4 ℃單獨孵育過夜；TBST液沖洗，加標記辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育2 h，洗膜后ECL試劑顯色，分別顯影成像，凝膠成像系統進行圖像分析，以β-actin蛋白條帶作為內參，結果用靶蛋白/β-actin比值表示。

1.2.5MTT法檢測細胞增殖收集對數生長期的大腸癌LOVO親本細胞，消化并調整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔100 μL，4 000個/孔。置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，小心棄去培養基。實驗根據以下分組進行，(1)單藥組(奧沙利鉑)：1.01、2.01、4.02、8.04 mg/L；(2)聯合用藥組：細胞先與50 μmol/L的GSK-3β特異性抑制劑SB415286共同孵育12 h后再加入上述終濃度的奧沙利鉑繼續培養。(3)對照組：不加藥及GSK-3β特異性抑制劑。每組樣品設3個復孔。24 h后小心吸去上清液，加入80 μL新鮮培養液，再加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，并繼續培養4 h。然后吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀570 nm處測量各孔的吸光度(A)值。計算細胞生長增值率(%)=A(實驗組)/A(對照組)×100%。

1.2.6Annexin-V/PI雙染檢測細胞凋亡取對數生長期的大腸癌LOVO親本細胞，按5×105cell/mL以1 mL體積接種于6孔板內。培養24 h后，根據以下分組分別繼續培養24 h：(1)正常培養組(不含奧沙利鉑及酶抑制劑SB415286)；(2) 奧沙利鉑(4.02 mg/L)組；(3)SB415286(50 μmol/L)組;(4)奧沙利鉑(4.02 mg/L)+SB415286(50 μmol/L)組。胰酶消化并離心收集細胞(1 000 r/min)，棄上清液， PBS 1 mL洗1次，離心；加入400 μL binding buffer和10 μL Annexin V-FITC，4 ℃孵育30 min；加入PBS 1 mL,離心洗滌1次；加入PI 5 μL，室溫避光5 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，汞激發波長488 nm，計數10 000個細胞。

2結果

2.1LOVO/L-OHP細胞株形態學觀察和遷移、侵襲能力檢測對前期建立的大腸癌奧沙利鉑耐藥細胞株LOVO/L-OHP在鏡下觀察，具有間葉細胞形態學特點，出現較多偽足(圖1)。Transwell細胞遷移實驗及Transwell細胞侵襲實驗結果發現LOVO/L-OHP細胞遷移侵襲能力均顯著高于大腸癌LOVO親本細胞，見圖2、3。

圖1　光鏡下大腸癌LOVO親本細胞與耐藥

*：P<0.05，與LOVO比較。

圖2大腸癌LOVO親本細胞與耐藥細胞株

LOVO/L-OHP遷移實驗結果

2.2大腸癌LOVO親本細胞與耐藥細胞株LOVO/L-OHP上皮細胞標志因子E-cadherin和間葉細胞標志因子Vimentin檢測采用Western blot檢測LOVO親本細胞與LOVO/L-OHP細胞E-cadherin和Vimentin蛋白水平，與LOVO親本細胞相比，LOVO/L-OHP細胞的E-cadherin表達下調，Vimentin上調(圖4)。EMT現象其重要特征就是腫瘤細胞的細胞膜E-cadherin上皮標記表達缺失，獲得間葉細胞表型，表達Vimentin，因而上述結果證實耐藥細胞株LOVO/L-OHP發生了EMT。

*：P<0.05，與LOVO比較。

圖3大腸癌LOVO親本細胞與耐藥細胞株

LOVO/L-OHP侵襲實驗結果

*：P<0.05，與LOVO E-cadherin比較；#：P<0.05，與LOVO Vimentin比較。

圖4LOVO親本細胞與LOVO/L-OHP細胞E-cadherin

和Vimentin蛋白Western blot檢測結果

A：SB415286處理誘導EMT對細胞遷移能力影響；B：SB415286處理誘導EMT對細胞侵襲能力影響。*：P<0.05，與48 h對照組比較;#：P<0.05，與72 h對照組比較。

圖5GSK-3β特異性抑制劑SB415286處理誘導

EMT對細胞遷移、侵襲能力的影響

2.3誘導EMT對大腸癌LOVO親本細胞表型的改變用GSK-3β特異性抑制劑SB415286處理大腸癌LOVO親本細胞以誘導EMT，檢測各組細胞遷移、侵襲能力及E-cadherin和Vimentin蛋白表達評價表型改變。結果發現48 h后SB415286處理組細胞開始遷移、侵襲能力顯著高于對照組，且50 μmol/L 劑量SB415286處理組顯著高于25 μmol/L 劑量SB415286處理組，呈一定的劑量依賴關系，72 h后亦呈現相同的趨勢(圖5)。用GSK-3β特異性抑制劑SB415286(25、50 μmol/L)處理細胞48 h后，發現E-cadherin蛋白顯著下調，Vimentin顯著上調，亦呈一定的劑量依賴關系(圖6)。

*：P<0.05，與LOVO E-cadherin比較；#：P<0.05，與LOVO Vimentin比較。

圖6GSK-3β特異性抑制劑SB415286 處理LOVO

親本細胞后E-cadherin和Vimentin蛋白

Western blot檢測結果

A：各劑量奧沙利鉑處理下大腸癌細胞株抑制率；B：奧沙利鉑(4.02 mg/L)+SB415286(50 μmol/L)組與奧沙利鉑(4.02 mg/L)組凋亡率。*：P<0.05，#：P<0.05，與奧沙利鉑(4.02 mg/L)組比較。

圖7誘導EMT對大腸癌細胞株化療敏感性的影響

2.4誘導EMT對大腸癌細胞株化療敏感性的影響通過MTT檢測發現，各劑量奧沙利鉑處理下SB415286+奧沙利鉑聯合用藥組抑制率均低于單藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測結果發現奧沙利鉑(4.02 mg/L)+ SB415286(50 μmol/L)組凋亡率顯著低于奧沙利鉑(4.02 mg/L)組，見圖7。

3討論

大腸癌是近二、三十年來發病數和死亡數在世界大多數國家和地區上升最快的腫瘤之一。在我國，大腸癌也是常見腫瘤之一，其中上海結直腸癌發病率已經接近西方發達國家的水平，位居惡性腫瘤發病率的第3位。化療作為大腸癌治療的重要手段，近十年來雖取得了較大進展，但療效始終不理想，究其原因，主要在于化療耐藥性的產生。近年研究表明EMT參與了一些腫瘤細胞對多種化療藥物耐藥性(MDR)的產生，其機制與經典的MDR完全不同，但目前尚缺乏EMT直接參與大腸癌細胞化療耐藥的直接證據。

EMT指上皮組織喪失上皮特征而獲得間葉的表型，是上皮細胞在特定的生理或病理情況下向間葉細胞轉分化的現象，是胚胎發育和創傷修復等過程中的基礎過程[4]。EMT過程首先是上皮組織基本結構消失，上皮細胞喪失細胞極性，細胞間緊密連接、錨定連接、橋粒和細胞角蛋白中間絲消失，細胞內的肌動蛋白微絲構成的細胞骨架應力纖維重新組合，并出現偽足，上皮細胞變形，遷移能力增強[5-6]。EMT過程是可逆的，在特定的條件下亦可發生間葉-上皮轉化(MET)。

EMT現象其重要特征就是腫瘤細胞的細胞膜E-cadherin等上皮標記表達缺失，獲得間葉細胞表型，表達Vimentin，細胞黏附能力減弱，遷移和侵襲能力增強[7]。EMT 的機制主要由于上皮細胞本身或周圍微環境改變，導致一系列信號傳導途徑激活，細胞核內相關轉錄因子發揮調控作用。不同程度的上皮細胞轉化過程是由精確的信號轉導機制調控，細胞外多種信號(Wnt、TGF、FGF-2和ILK等)通過與細胞表面特異受體結合，活化不同的核內轉錄因子(Twist、Snail、Slug、LFE-1和HMGA2等)[8]，這些轉錄因子的共同特征是含有能識別靶基因啟動子上的E-box基序的DNA 結合序列，從而調節靶基因表達，啟動EMT。

近年研究發現，上皮源性腫瘤細胞EMT在腫瘤細胞化療耐藥中發揮重要作用。Shah等[9]研究發現，吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞株出現典型的EMT表型改變，細胞黏附能力減弱，侵襲和遷移能力增強；細胞膜E-cadherin、β-catenin表達缺失，細胞質Vimentin表達增強。Cheng 等[10]報道了紫杉醇耐藥的乳腺癌、Kajiyama等[11]也報道了紫杉醇耐藥的卵巢癌等腫瘤細胞均出現了典型的EMT形態學改變和表型特征。而另有研究表明，過表達Twist和Snail 的腫瘤細胞顯示明顯的化療抵抗，敲除后可增強腫瘤細胞化療敏感性[12]。新近研究也發現，用RNAi沉默調控EMT信號途徑關鍵因子Snail和Twist可增強肺癌細胞順鉑化療敏感性[13]。從以上研究發現可以看出EMT與多種上皮源性腫瘤化療耐藥存在密切關系，但是否為上皮源性腫瘤的特異性機制、EMT是否同樣參與其他類型腫瘤化療耐藥，以及EMT參與大腸癌化療耐藥的具體機制還有待深入研究。

綜上所述，本研究從耐藥細胞株LOVO/L-OHP的EMT發生與誘導EMT對大腸癌細胞表型的改變和化療敏感性的影響兩個角度證實了EMT與大腸癌化療耐藥間的直接關系，獲得了EMT參與大腸癌化療耐藥的直接證據，從而為未來干預大腸癌化療耐藥性的治療奠定基礎并提供新的研究策略。

參考文獻

[1]徐富星．大腸癌研究現狀[J]．國際消化病雜志，2006(6)：365-366,424．

[2]Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-Mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell,2009,139(5):871-890.

[3]Ahmed N,Abubaker K,Findlay J,et al.Epithelial mesenchymal transition and cancer stem cell-like phenotypes facilitate chemoresistance in recurrent ovarian cancer[J].Curr Cancer Drug Targets,2010,10(3):268-278.

[4]Hay ED.The extracellular matrix in development and regeneration.An interview with Elizabeth D[J].Hay Int J Dev Biol,2004,48(8/9):687-694.

[5]Huber MA,Beug H,Wirth T.Epithelial-mesenchymal transition:NF-kappaB takes center stage[J].Cell Cycle,2004,3(12):1477-1480.

[6]Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J].Nat Rev Cancer,2002,2(6):442-454.

[7]Guarino M.Epithelial-mesenchymal transition and tumour invasion[J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(12):2153-2160.

[8]Gavert N,Ben-Ze′ev A.Epithelial-mesenchymal transition and the invasive potential of tumors[J].Trends Mol Med,2008,14(5):199-209.

[9]Shah AN,Summy JM,Zhang J,et al.Development and characterization of gemcitabine-resistant pancreatic tumor cells[J].Ann Surg Oncol,2007,14(12):3629-3637.

[10]Cheng GZ,Chan J,Wang Q,et al.Twist transcriptionally up-regulates AKT2 in breast cancer cells leading to increased migration,invasion,and resistance to paclitaxel[J].Cancer Res,2007,67(5):1979-1987.

[11]Kajiyama H,Shibata K,Terauchi M,et al.Chemoresistance to paclitaxel induces epithelial-mesenchymal transition and enhances metastatic potential for epithelial ovarian carcinoma cells[J].Int J Oncol,2007,31(2):277-283.

[12]Zhuo W,Wang Y,Zhuo X,et al.Knockdown of snail,a novel Zinc finger transcription factor,via RNA interference increases a549 cell sensitivity to cisplatin via JNK/mitochondrial pathway[J].Lung Cancer,2008,62(1):8-14.

[13]Zhuo WL,Wang Y,Zhuo XL,et al.Short interfering RNA directed against TWIST,a novel Zinc finger transcription factor,increases A549 cell sensitivity to cisplatin via MAPK/mitochondrial pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,369(4):1098-1102.

The study on association between epithelial mesenchymal transition and Oxaliplatin resistance for colorectal carcinoma*

Jia Houjun1,Xiang Lin2

(1.DepartmentofGastroenterologicalSurgery;2.ClinicalResearchCenter,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

[Abstract]ObjectiveDrug resistance is the main reason for chemotherapy failure,it is to be solved how to overcome this.Recent studies indicate that epithelial-mesenchymaltransition (EMT) may involved in chemotherapy resistance for some types of cancers.But it is still unknown whether EMT is involved in chemotherapy resistance for colorectal carcinoma.This study was conducted to investigate the relation between EMT and colorectal cancer chemotherapy resistance.MethodsAbilities of migration and invasion of Oxaliplatin resistant colorectal carcinoma cell lines LOVO/L-OHP and wild type colorectal carcinoma cell lines LOVO were investigated by transwell migration and transwell invasion assays.The level of E-cadherin and Vimentin was detected by Western blot.EMT of LOVO was induced by GSK-3β inhibitor SB415286 treatment and validated by transwell migration and transwell invasion assays and Western blot for E-cadherin and Vimentin.The sensitivity of LOVO to Oxaliplatin after SB415286 inducing EMT was evaluated by MTT and Annexin-V/PI assays.ResultsEMT phenotype was confirmed by morphology feature,results of transwell migration and invasion assays and level changes of E-cadherin and Vimentin.In addition,the results of proliferation and apoptosis tests showed that the sensitivity of LOVO to Oxaliplatin after SB415286 inducing EMT decreased significantly,which means chemotherapy resistance.ConclusionThe direct association between EMT and chemotherapy resistance for colorectal carcinoma is proved in this study,which provides basis for intervening chemotherapy resistance and new researching strategies.

[Key words]epithelial mesenchymal transition;colorectal carcinoma;Oxaliplatin

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.002

*基金項目：重慶市衛生局面上項目(2011-2-051)。

作者簡介：賈后軍(1975-)，副主任醫師，博士，主要從事大腸癌的基礎與臨床研究。

[中圖分類號]R735.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2308-04

(收稿日期：2015-12-02修回日期：2016-01-17)