IRE1-XBP1通路調控肝巨噬細胞極性的機制研究*

胡大仁,程　黎,劉　燕,劉一鳴,李金政,龔建平,茍劍林△

(1.重慶三峽中心醫院肝膽外科，重慶萬州 404000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科　400010)

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IRE1-XBP1通路調控肝巨噬細胞極性的機制研究*

胡大仁1,程黎1,劉燕1,劉一鳴2,李金政2,龔建平2,茍劍林1△

(1.重慶三峽中心醫院肝膽外科，重慶萬州 404000；2.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科400010)

[摘要]目的分離、培養LEWIS大鼠肝臟肝巨噬細胞(KCs)，觀察肌醇酶1-X盒連接蛋白1(IRE1-XBP1)通路活性改變對KCs功能的調控的作用機制。方法(1)采取Ⅳ型膠原酶消化肝臟聯合非連續梯度離心法分離Lewis大鼠KCs；(2)鑒定后的KCs分為4組： XBP1沉默組(XBP1-shRNA組)、錯義序列沉默對照組(Ctrl-shRNA組)；Adv-XBP1過表達組(AdV-XBP1組)、錯義序列過表達對照組(Ctrl-AdV組)；(3)實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組KCs中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17轉錄水平；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測JAK1、JAK2、STAT1及STAT3的蛋白表達水平；(4)流式細胞術(FCM)及激光共聚焦檢測各組KCs表型的變化情況；(5)分離大鼠脾臟淋巴細胞，尼龍毛柱過濾純化T細胞，與上述各組KCs共培養， Brdu滲入法檢測T細胞增殖情況；(6) Annexin V/PI法FCM觀察T淋巴細胞凋亡情況；(7)酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10水平。結果(1)RT-PCR結果顯示，XBP1-shRNA組中XBP1的表達量較對照組顯著降低，而在Adv-XBP1組則明顯上調(P<0.05)；(2)FCM發現，XBP1-shRNA組中MHC-Ⅱ、CD86、CD40的表達明顯低于對照組，而CD204和CD206的表達則顯著高于對照組；而在Adv-XBP1組，則呈相反趨勢；(3)Western blot檢測發現XBP1-shRNA組中JAK1、JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表達及其磷酸化水平均受到抑制，而在Adv-XBP1組則上述蛋白的表達及磷酸化水平得到顯著增強；(4)Brdu發現抑制KCs 中IRE1-XBP1活性后T細胞增殖受到明顯抑制，凋亡增加，促炎細胞因子分泌減少，抗炎細胞因子分泌增加(P<0.05)，而上調KCs中IRE1-XBP1活性后T細胞增殖則明顯增強，凋亡明顯減少，促炎細胞因子分泌增加，抗炎細胞因子分泌減少(P<0.05)。結論KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以轉化KCs的極性狀態，并通過調節JAK-STAT家族成員表達，調控KCs自分泌細胞因子的組成成分；KCs中IRE1-XBP1通路活性變化可以影響共培養初始T淋巴細胞的增殖分化、凋亡及相關細胞因子的分泌。

[關鍵詞]X盒結合蛋白1;肝巨噬細胞;極性調節

目前認為，急性排斥反應發生的實質是持續的炎癥反應及炎癥因子蓄積浸潤。而抗原遞呈細胞是誘導炎癥反應及炎癥因子趨化的核心因素[1-2]。筆者前期發現，作為肝血竇內的固有巨噬細胞，也是機體最大的抗原遞呈細胞群的肝巨噬細胞(kupffer cells,KCs)，活化后具有即可促進急性排斥反應，也能調控下游相關耐受分子表達改變，有利于免疫抑制的雙重“性格”。但其具體機制尚不清楚。嘗試增強其下游耐受相關分子的表達，僅能延緩排斥反應的發生[3-4]。其原因可能與忽略了KCs活化后M1/M2極性調節相關。

前期對肌醇酶1-X盒連接蛋白1(inositol requiring enzyme 1-X-box binding protein 1,IRE1-XBP1)通路的研究主要局限于非折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)中[5]。新近文獻報道，IRE1-XBP1通路活性改變參與了調節B淋巴細胞分化、樹突狀細胞等抗原遞呈細胞功能穩態、巨噬細胞分泌性質等諸多免疫調控環節[6-7]。而KCs作為機體最大的巨噬細胞群/APC群，IRE1-XBP1通路調控KCs的作用，尚未見相關報道。本課題組認為,IRE1-XBP1通路可能在調控KCs功能及其自分泌細胞因子中起著關鍵作用。本研究中，筆者以大鼠肝臟KCs為靶細胞，分別轉染XBP1-shRNA及AdV-XBP1，觀察其功能極性的改變，以及對初始T淋巴細胞激活分化的影響，從體外實驗的角度初步探討以KCs 中IRE1-XBP1通路為作用靶點調控細胞免疫的可能機制。

1材料與方法

1.1材料健康近交系6～8周齡Lewis(Rtl1)大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養于SPF級實驗室。給予標準鼠料喂養，12 h晝夜節律，正常飲水。術前8～12 h禁食。主要試劑：Ⅳ型膠原酶購于Santa Cruz公司；小鼠抗大鼠XBP1、MCH-Ⅱ、CD86、CD204、CD206、CD163抗體購自Abcam公司；兔抗大鼠JNK、JAK1、STAT3單克隆抗體購自eBioscience公司；PrimeScriptTMRTreagent Kit試劑盒購于Takara公司；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購于Sigma公司。所有操作遵守重慶醫科大學倫理委員會指南。

1.2方法

1.2.1沉默及過表達質粒的構建干擾質粒與過表達質粒及其錯義序列對照質粒的構建交由上海英濰捷基貿易有限公司代為構建。選擇載體分別是pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP和pcDNA6.2TM-GW/EmGFP。質粒抽取按照OMEGA質粒抽取試劑盒說明書進行，最終調整質粒濃度為500 ng/μL。參照脂質體Lipofectamine2000說明書指導進行胞內轉染操作。

1.2.2KCs分離培養及分組取Lewis大鼠肝組織，加入終濃度為0.1%的Ⅳ型膠原酶后劃碎并水浴，經200目細胞篩過濾后得到肝細胞懸液。經4次離心后得到含少量紅細胞的肝臟非實質細胞懸液。采用2 h選擇性貼壁法純化KCs。常規培養3 d后，取KCs種于6孔板(1×106個/孔)，參照脂質體Lipofectamine2000說明書指導分別轉染XBP1-shRNA、AdV-XBP1及其對照質粒。分組如下：XBP1沉默組(XBP1-shRNA組，滴度為3×108TU/mL)，錯義序列質粒沉默對照組 (Ctrl-shRNA組，滴度為3×108TU/mL)，AdV-XBP1過表達組(AdV-XBP1組，滴度為3×108TU/mL)，錯義序列質粒過表達對照組(Ctrl-AdV組,滴度為3×108TU/mL)。

1.2.3實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測各組中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17 mRNA表達水平按Trizol試劑盒說明書提取KCs及肝臟總組織RNA，XBP1上游引物：5′-ATC GTC GAC CCG GGA CTA CAG GAC CAA TA-3′，下游引物：5′-GCG CAA GCT TAT GTG ATG GTC AGG GAA AGG-3′；IL-6上游引物：5′-AGA TAA CAA GAA AGA CAA AGC CAG AGT C-3′，下游引物：5′-GCA TTG GAA ATT GGG GTA GGA AG-3′；IFN-γ上游引物：5′-ATG AAC GCT ACA CAC TGC ATC-3′，下游引物：5′-TAG GCT TTC AAT GAC TGT -3′；TNF-α上游引物：5′-TCT ACT GAA CTT CGG GGT GAT CG-3′，下游引物：5′-CGT GGG CTA CAG GCT TGT A-3′；IL-17上游引物：5′-CTC AAC CGT TCC ACG TCA CCC -3′，下游引物：5′-CCA GCT TTC CCT CCG CAT-3′；利用SYBRPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒測定RNA的逆轉錄的表達情況。RT-PCR結果采取2-△△Ct法分析表達基因的表達差異，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。以上實驗均重復3次。

1.2.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組KCs中XBP1、JAK、STAT的蛋白表達按照總蛋白提取試劑盒說明書提取KCS和移植肝臟總蛋白進行含量測定，常規行Western blot測定，一抗濃度稀釋成1∶200；二抗濃度稀釋成1∶2 000顯影后BioRad系統捕獲圖片，Quantity One分析。以上實驗均重復3次。

1.2.5流式細胞術檢測KCs表型分子表達將轉染后48 h各組KCs分為LPS處理及對照兩個亞組，加入不同熒光素標記的兔抗大鼠MHC-Ⅱ、CD206、CD204、CD40和單克隆抗體避光孵育2 h。打開機器及氬離子光源，預熱，機器自動初始化。用標準熒光微球校準，熒光信號的變異系數設置小于3%。孵育相應二抗，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，1 h內上機檢測，每個亞組取1×104個細胞，FlowJo分析結果。以上實驗均重復3次。

1.2.6T淋巴細胞共培養及功能檢測取經卵清蛋白(OVA)皮下免疫2次的Lewis鼠脾組織制作脾細胞懸液，經梯度離心法獲混合淋巴細胞懸液，用尼龍毛柱(Wako)過濾純化。培養液中加入終濃度為100 μmol/L的Brdu工作液。將5×105個T細胞按5∶1比例與上述各轉染的KCs在6孔培養板中進行混合培養72 h，按照Brdu試劑說明書進行處理，用 Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的紅光作為判斷所有照片陽性的統一標準，陽性率=陽性細胞數/核數量。將5×105個T細胞按5∶1配置與上述各組KCs在96孔板中混合培養72 h，每孔加入1 μg/mL OVA323-339，刺激后收集細胞液，離心后加入Annexin V-FITC及 PI，上機，激發波長為488 nm(綠光)和630 nm(紅光)，檢測凋亡。以上實驗均重復3次。

1.2.7ELISA檢測取各組共培養上清液，按ELISA試劑盒標準步驟操作，檢測各組中IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-17的表達差異。以上實驗均重復3次。

2結果

2.1各組KCs中XBP1轉錄、表達的變化轉染48 h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白大量表達。其轉染效率約為87%(圖1A)。RT-PCR提示：XBP1-shRNA組、Ctrl-shRNA組、AdV-XBP1組及Ctrl-AdV組中XBP1 mRNA相對表達量分別為0.58±0.07、8.81±1.28、48.65±5.82和10.31±1.74(圖1B)。 XBP1-shRNA組中XBP1的轉錄水平較其余3組明顯受到抑制(P<0.05)，提示XBP1-shRNA質粒有效抑制KCs中XBP1正常生理量的表達水平；而在AdV-XBP1組中，XBP1 mRNA的轉錄活性較其余3組則明顯上調(P<0.05)。Western blot檢測各組KCs中XBP1蛋白表達水平，其結果顯示：XBP1-shRNA組、Ctrl-shRNA組、AdV-XBP1組及Ctrl-AdV組中XBP1的蛋白相對表達水平分別為0.14±0.04、0.49±0.01、0.84±0.02、0.53±0.07。Western blot結果(圖1C)與RT-PCR的趨勢相一致。

2.2IRE1-XBP1通路對KCs極性的影響

2.2.1IRE1-XBP1通路活性對KCs表型分子的影響MHC-Ⅱ、CD40、CD86等功能分子是決定KCs抗原呈遞細胞呈遞功能，以及活化初始T細胞功能的關鍵因子，其高表達提示KCs呈M1型極化。而CD204及CD206則是M2型KCs的表面特異性標志物。FCM顯示：XBP1-shRNA組中MHC-Ⅱ(28.56±1.34)%、CD40(31.75±5.87)%和CD86(18.24±2.63)%較Ctrl-shRNA組MHC-Ⅱ(68.74±12.56)%、CD40(72.60±12.45)%和CD86(57.76±9.74)%明顯下調(P<0.05)。在AdV-XBP1組中，MHC-Ⅱ(89.46±21.43)%、CD40(72.60±15.74)%及CD86(86.17±24.28)%]的表達水平與Ctrl-AdV組(60.39±18.73)%、(49.24±18.45)%和(59.13±15.67)%相比則顯著增加(P<0.05)。但是CD204及CD206分子在各組中的表達水平則呈相反趨勢，CD204和CD206在XBP1-shRNA組的表達水平分別為(47.22±9.84)%和(45.67±11.37)%，較AdV-XBP1中CD204(12.54±3.41)%和CD206(12.31±3.34)%的明顯上升(P<0.05),見圖2A。

2.2.2IRE1-XBP1通路對KCs自分泌細胞因子的影響RT-PCR檢測上清液中促炎細胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17轉錄調控變化。PCR結果(圖2B)；XBP1-shRNA組與Ctrl-shRNA組比較，IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17的mRNA表達量均受到明顯的抑制(P<0.05)；而AdV-XBP1組與Ctrl-shRNA組比較，這類促炎細胞因子的表達量則明顯上調(P<0.05)。

2.3IRE-1-XBP1通路經由JAK-STAT通路影響KCs細胞因子分泌改變結果顯示，抑制IRE1-XBP1通路的活性，JAK家族中JAK1與JAK2(圖3A)和STAT家族成員中STAT1及STAT3(圖3B)自身蛋白表達及其磷酸化水平均受到抑制(P<0.05)。而促進IRE1-XBP1通路的表達或傳導，JAK家族及STAT家族上述成員的蛋白表達量及其磷酸化水平均得到顯著提升(P<0.05)。Western blot結果提示，IRE1-XBP1調控KCs自分泌細胞因子成分改變很有可能是通過JAK-STAT通路而實施的。但有待進一步的驗證。

A:轉染后48 h KCs內綠色熒光蛋白表達；B:RT-PCR檢測轉染后48 h各組KCs中XBP1的基因轉錄水平；C:Western blot檢測KCs中XBP1蛋白的表達。

圖1 轉染后各組KCs中XBP1轉錄、表達的變化

A:各組KCs表型分子改變柱狀圖分析;B：各組KCs分泌細胞因子mRNA的表達水平。

圖2IRE1-XBP1通路對KCs極性的影響

2.4KCs中IRE1-XBP1通路活性對活化T細胞的影響

2.4.1IRE1-XBP1通路活性對活化T細胞增殖的影響Brdu摻入法檢測共培養T淋巴細胞增殖結果顯示，XBP1-shRNA組中，標記了紅光的陽性率為(14.69±2.31)%，較Ctrl-shRNA組的(21.32±5.41)%，T淋巴細胞分裂增殖的能力明顯受到抑制(P<0.05)。而在AdV-XBP1組中，AdV-XBP1組(40.80±7.54)%較Ctrl-AdV組(22.03±4.76)%，T淋巴細胞分裂增殖的能力得到明顯加強(P<0.05)，見圖4A。

2.4.2IRE1-XBP1通路活性對活化T細胞凋亡的影響采取Annexin V-FITC/PI法檢測T淋巴細胞凋亡情況發現：T淋巴細胞在XBP1-shRNA組(42.17±8.74)%凋亡明顯高于Ctrl-shRNA組(23.74±4.16)%，而在AdV-XBP1組(10.95±3.79)%凋亡明顯低于Ctrl-AdV(21.87±3.72)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4B。

A：IRE1-XBP1對JAK1和JAK2蛋白表達及磷酸化水平的調控，B：IRE1-XBP1對STAT1和STAT3蛋白表達及磷酸化水平的調控。*：P<0.05，與Ctrl-shRNA組比較;#：P<0.05，與Ctrl-AdV組比較。

圖3IRE-1-XBP1通路對JAK-STAT通路的調節

2.4.3KCs中IRE1-XBP1通路對活化T細胞分泌細胞因子的影響共培養上清液ELISA檢測結果顯示，IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17在XBP1-shRNA組中，與Ctrl-shRNA組比較，其分泌均受到不同程度的抑制；而在AdV-XBP1組，與Ctrl-AdV比較，上述4種細胞因子的分泌顯著增高(P<0.05)。但IL-10在XBP1-shRNA組中的水平卻明顯高于其在Ctrl-shRNA組中的表達，而AdV-XBP1組與Ctrl-AdV組比較，則IL-10分泌明顯減少(P<0.05)，見圖5。

A:各組KCs對T淋巴細胞增殖的影響；B:各組KCs對T淋巴細胞凋亡的影響;*：P<0.05，與Ctrl-shRNA組比較，#：P<0.05，與Ctrl-AdV組比較。

圖4KCs中IRE1-XBP1對初始T淋巴細胞的影響

*：P<0.05,與Ctrl-shRNA組比較；#：P<0.05與Ctrl-AdV組比較。

圖5各組KCs對T淋巴細胞分泌細胞因子改變的影響

3討論

目前主流觀點認為，APCs的功能和T細胞激活分化在AcR中占據關鍵的位置，對兩者的特異性調控，可影響移植耐受或排斥免疫反應[8]。KCs通過模式識別受體(PRRs)識別外來抗原，再經由TLR4等途徑，進行信號傳導，發生極化。M1型KCs主要由IFN-γ及LPS等因素誘導極化，可大量分泌促炎細胞因子、促進Th1/Th17類反應，具備很強的抗原呈遞功能。其表面標志物包括IL-12、MHC-Ⅱ、CD68、NOS2、IL-10等。M2型KCs與Th2型免疫反應關系密切，極化的M2型KCs表型為IL-12、MHC-Ⅱ、IL-10、CD204、CD206、IL-1decoyR[9-10]。

本實驗中，通過抑制或上調IRE1-XBP1的活性及傳導，發現降低KCs中IRE1-XBP1通路活性，能有效抑制經LPS活化的KCs表面MHC-Ⅱ的表達水平，與文獻報道結果一致[11]。此外，抑制這一通路的活性，也削弱共刺激分子CD40及CD68的表達。但KCs表面M2型標志物CD204及CD206的表達水平則明顯上升，使得KCs表型改變為MHC-Ⅱ、CD68、CD204、CD206，更符合M2型KCs的表型特征。在上調這一通路活性時，則MHC-II、CD40同CD86的表達水平得到明顯的增強，而CD204及CD206的表達則明顯受限。KCs表型呈MHC-Ⅱ、CD68、CD204、CD206，與M1型表型相近。此外筆者還測定了不同IRE1-XBP1活性對KCs自身分泌促炎因子的基因及蛋白的轉錄水平，發現抑制IRE1-XBP1通路的活性， KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α和IL-17減少，而上調這一通路的活性，則明顯促進這類促炎因子的表達。而這一改變可能是通過對JAK1、JAK2及STAT1和STAT3的蛋白及磷酸化水平的調控而實現的。但本研究未能確認IRE1-XBP1主要調控JAK-STAT中的哪一條通路，這幾者間的關系還有待更深入的研究。以上結果證實，IRE1-XBP1的活性改變可以誘導KCs的極性變化。為進一步確認IRE1-XBP1通路誘導的KCs極性變化所產生的生物學效應改變，筆者將4組KCs分別與T淋巴細胞進行了共培養，發現抑制KCs中IRE1-XBP1通路，T淋巴細胞活化增殖能力被削弱，凋亡水平明顯上升，且促炎細胞因子分泌受抑制，抑炎因子分泌上調。提示KCs提呈抗原激活T細胞的能力明顯減弱，表現出類似于M2型KCs的生物學效應。而上調該通路，則表現出類似于M1型KCs的生物學效應。

綜上所述，抑制KCs中IRE1-XBP1通路的活性，可以誘導M1樣極化的KCs呈M2樣轉化，并表現出對炎癥反應的負性調控效用。為進一步明確KCs中IRE1-XBP1通路在炎癥反應亦或肝移植術后急性排斥反應中的作用積累一定的理論基礎。

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The effect of IRE1-XBP1 pathway on regulation of polarization in activated Kupffer cells*

Hu Daren1,Cheng Li1,Liu Yan1,Liu Yiming2,Li Jinzheng2,Gong Jianping2,Gou Jianlin1△

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,ChongqingThreeGorgesCentralHospital,Wanzhou,Chongqing404000,China;2.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

[Abstract]ObjectiveTo isolate and culture rats liver KCS,and to explore the effect of IRE1-XBP1 pathway on regulation of polarization in activated Kupffer cells(KCs).Methods(1)Rat KCs were isolated by Ⅳ type collagenase digestion and gradient centrifugation methods.(2)KCs were transfected and randomly divided into four groups:XBP1-shRNA group,Ctrl-shRNA group,AdV-XBP1 group and Ctrl-AdV group.(3)The transfection level of KCs XBP1,IL-6,IFN-γ,TNF-α and IL-17 were detected by RT-PCR;the protein expression level of JAK1,JAK2,STAT1 and STAT3 were evaluated by Western blot.(4)The changes of KCs expression type in each group were detected by flow cytometry (FCM) and the laser confocal.(5)T cells derived from rat spleen cells were co-cultured within the 4 groups of KCs mentioned above;T cells proliferation was measured by Brdu labeling assay.(6)T cells apoptosis was determined by Annexin V/PI FCM analysis.(7)The density of IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17 and IL-10 in the supernatant of co culture was assessed by ELISA.Results(1)The mRNA and protein level of XBP1 were measured by RT-PCR and western blot,those in XBP1-shRNA group were significantly reduced compared with those in the other three groups,while in AdV-XBP1 groups,results demonstrated entirely the opposite tendency (P<0.05).(2)The expression of marker molecules on the surface of KCs such as MHC Ⅱ,CD86 and CD40 in XBP1-shRNA group were significantly lower (P<0.05),but CD204 and CD206 expression were much higher compared with the other three (P<0.05).However the expression tendency of these surface markers were shown the opposite results in AdV-XBP1 group (P<0.05).(3)Western blot revealed the XBP1-shRNA could statistically suppress the protein levels and phosphorylation of JAK1,JAK2,STAT1 and STAT3,which involved in the pro inflammatory cytokines regulation and KCs polarization (P<0.05).But in AdV-XBP1 group,these protein and its phosphorylation were markedly promoted (P<0.05).ELISA results collaborated with Western blot.(4)3 d after co cultured with KCs transfected with XBP1-shRNA,the levels of T lymphocyte proliferation and pro inflammatory cytokines secretion were significantly reduced,but the levels of T lymphocyte apoptosis and anti inflammatory cytokines secretion were remarkably enhanced(P<0.05).ConclusionBlockage of IRE1-XBP1 activation could alter the phenotype of active KCs to M2 like type and attenuated the capacity of antigen present of KCs,while up regulated the expression of IRE1-XBP1 pathway could change the phenotype of KCs to M1 type plus the promotion of antigen present capacity.

[Key words]X binding protein 1;Kupffer cells;polarization regulation

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.004

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81200329)；重慶市衛生局項目( 2013-2-168)。

作者簡介：胡大仁(1978-)，主治醫師，本科，主要從事肝膽胰腺疾病研究。△通訊作者,Tel：13896322336;E-mail:goujianlin8899@163.com。

[中圖分類號]R392.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2314-05

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-01-04)