siRNA抑制HMGA1基因表達對LX-2細胞生物學功能的影響*

胡　蕾,劉　莉,張　霜,杜芳騰,張吉翔

(南昌大學第二附屬醫院消化內科/江西省分子醫學重點實驗室，南昌 330006)

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siRNA抑制HMGA1基因表達對LX-2細胞生物學功能的影響*

胡蕾,劉莉,張霜,杜芳騰△,張吉翔

(南昌大學第二附屬醫院消化內科/江西省分子醫學重點實驗室，南昌 330006)

[摘要]目的探討高遷移率蛋白A1(HMGA1)siRNA對人肝星狀細胞HMGA1、α-SMA、E-鈣黏素(E-cadherin)基因的表達調控作用及增殖活性的影響，并探討其可能的機制。方法將有效的人工合成的HMGA1 siRNA轉染人肝星狀細胞LX-2(LX-2)后沉默HMGA1基因的表達。通過實時熒光定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測LX-2細胞中HMGA1、α-SMA和E-cadherin的mRNA及蛋白表達水平。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測LX-2細胞增殖水平。結果以HMGA1-siRNA序列1組沉默效果最好。TGF-β1刺激組與TGF-β1+NC-siRNA組之間細胞增殖水平、HMGA1、α-SMA、E-cadherin的基因及蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，細胞增殖水平、HMGA1、α-SMA表達均明顯高于正常對照組(P<0.05)，E-cadherin表達顯著低于正常對照組(P<0.05)；TGF-β1+HMGA1 siRNA組細胞增殖水平及HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達水平較另外3組均顯著下降(P<0.05)，E-cadherin表達水平顯著增高(P<0.05)。結論靶向HMGA1的siRNA能夠沉默LX-2中HMGA1的表達；抑制TGF-β1誘導的LX-2增殖水平，提示HMGA1參與了TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化。

[關鍵詞]高遷移率蛋白A1；RNA干擾；肝星狀細胞；肝纖維化

肝纖維化是在各種致病因素作用下肝臟內纖維結締組織異常增生的代償反應，其本質是肝臟組織內細胞外基質合成大于降解[1]。研究表明某些干預措施如促進細胞外基質降解可促使肝纖維化進程逆轉[2]。肝損傷過程中，肝星狀細胞被激活發生表型轉化后能夠獲得肌成纖維細胞特性，進而增加細胞收縮性和膠原合成，這種過程受多種細胞因子調控。Shimada等[3]用纖維化過程中的重要轉化刺激因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導24 h來激活人肝星狀細胞LX-2(hepatic stellate cell LX-2，LX-2)來構建體外肝纖維化實驗模型。高遷移率族蛋白A1(high mobility group AT-hook 1，HMGA1)是高遷移率族蛋白中一員，作為轉錄因子的輔助因子參與真核生物的轉錄過程[4]。文獻報道HMGA1基因在不同胚胎起源的腫瘤相關基因的轉錄調控過程中發揮著重要的作用[5]。但HMGAl在肝纖維化中的表達研究報道尚罕見。本研究旨在通過干擾人LX-2細胞中HMGA1基因的表達，研究其對LX-2生物學功能的影響，初步探討HMGA1在肝纖維化形成過程中的作用。

1材料與方法

1.1材料人肝星狀細胞LX-2購自湘雅中心實驗室細胞庫。試劑：重組人TGF-β1(美國PeproTech公司)；胎牛血清(FBS,美國Hyclone公司)；DMEM培養基、0.25%胰酶、溴化乙錠(EB，上海索來寶生物科技有限公司)；FuGENE6(美國羅氏公司)。實時熒光室量PCR(RT-PCR)所需的Trizol(美國Invitrogen公司)；Taq PCR Super Mix、DNA MarkrⅠ(北京天根生化科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(加拿大Fermenters公司)。總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)。各目的基因引物由上海捷瑞公司合成。兔抗人HMGA1、α-SMA及E-鈣黏素(E-cadherin)單克隆抗體均購自英國Abcam公司，山羊抗鼠IgG、鼠抗人β-actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。四甲基偶氮唑藍(MTT，上海普飛生物科技有限公司)。DEPC(Diethyl pyrocarbonate)、二甲亞砜(DMSO，美國Ameresco公司)。

1.2方法

1.2.1siRNA的設計與合成Negative siRNA control(NC-siRNA)作為陰性對照由廣州市銳博生物科技有限公司設計并合成，另設計與合成含3對HMGA1-siRNA序列(BC004924)的siRNA，分別是HMGA1-siRNA-1，HMGA1-siRNA-2和HMGA1-siRNA-3，見表1、2。

表1各引物序列

表2　3組特異性HMGA1 siRNA序列

1.2.2人肝星狀細胞株LX-2的培養及傳代用混合培養基DMEM[含10%胎牛血清(Hyclone )、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素]于37 ℃、含5% CO2的孵箱中培養，細胞貼壁生長，用0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。

1.2.3細胞轉染及有效HMGA1 siRNA篩查將細胞分為以下6組：空白對照組(只轉染脂質體，無特異性siRNA)、正常對照組(正常培養的LX-2細胞)、陰性對照組(HMGA1 NC-siRNA)、HMGA1-siRNA-1組、HMGA1-siRNA-2組及HMGA1-siRNA-3組。將處于對數生長期的LX-2以2×105個/孔的密度鋪于6 孔板中，常規培養，待細胞貼壁達30%～50%融合率時進行轉染。轉染前，換用不含血清和抗生素的DMEM培養基2 mL培養。按FuGENE6試劑盒說明書操作。轉染后6 h，換成常規含5% FBS的DMEM培養液繼續培養48 h。分別提取RNA及總蛋白，采用半定量實時熒光定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測HMGA1基因和蛋白的表達，重復3次。篩選出對HMGA1干擾效果最佳的一組序列用于實驗。

1.2.4HMGA1-siRNA對經過TGF-β1刺激后的LX-2細胞中HMGA1、α-SMA、E-cadherin表達的影響將細胞分為4組：TGF-β1刺激組(經TGF-β1處理，未轉染)、TGF-β1+NC-siRNA組(經TGF-β1處理，轉染加入NC siRNA)、TGF-β1+HMGA1-siRNA組(經TGF-β1處理，轉染加入HMGA1-siRNA)、對照組(無TGF-β1刺激，未轉染)，其中培養液中TGF-β1終濃度為10 ng/mL。轉染步驟同前，轉染24 h后，再加入TGF-β1孵育24 h，提取各組總RNA及總蛋白，采用Western blot和半定量RT-PCR檢測HMGA1、α-SMA、E-cadherin蛋白和基因的表達。

1.2.5半定量RT-PCR檢測按Trizol試劑盒操作說明提取細胞總RNA，取光密度(OD)260/280比值接近2.0的RNA進行試驗。應用Fermentas逆轉錄試劑盒，取6 μL RNA反轉錄成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。參照Two-Step RT-PCR試劑盒操作說明書進行RT-PCR，取2 μL cDNA，總反應體積為25 μL，進行PCR反應。擴增條件，HMGA1：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。α-SMA：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。E-cadherin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。β-actin：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含5 mg/L溴化乙錠)后，紫外燈下觀察結果。通過Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，獲得相應組的HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA的相對表達量(均以β-actin來標化)。

1.2.6Western blot檢測按蛋白提取試劑盒說明進行Western blot檢測，提取各組細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg的蛋白調至等體積上樣，經不同濃度(HMGA1、α-SMA、E-cadherin分別用15%、12%及6%)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，繼而把蛋白轉移至PVDF膜上，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST液室溫封閉2 h，分別加封閉液稀釋的Ⅰ抗：HMGA1(1∶1 000)、α-SMA(1∶800)、E-cadherin(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)置于4 ℃孵育過夜，洗滌后加入用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，洗滌后經顯色、曝光、顯影、定影后拍照并觀察結果，用β-actin標化，經Quantity One圖像分析軟件獲得各組蛋白相對表達量。

1.2.7MTT比色法檢測細胞增殖轉染前1 d收集對數生長期的LX-2細胞并接種于96孔板中。依1.2.3的分組及轉染方式操作。分別在每孔加入含有10%MTT溶液20 μL，常規培養4 h后加入DMSO。酶標儀測定4組細胞各孔吸光度(A)值(492 nm)，計算各組均值。

2結果

2.1HMGA1基因沉默對LX-2細胞中HMGA1 mRNA、蛋白表達的影響 用脂質體轉染法將siRNA轉染LX-2細胞后，3個干擾組的細胞內HMGA1 mRNA表達水平均較其他對照組降低(P<0.05)。其中HMGA1-siRNA-1組干擾效果最好，mRNA表達最少(P<0.05)。Western blot檢測結果與半定量RT-PCR檢測一致，HMGA1的蛋白表達量顯著下降(P<0.05),見圖1、2。

2.2HMGA1-siRNA對經過TGF-β1刺激后的LX-2細胞中HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達的影響半定量RT-PCR結果顯示，TGF-β1+NC-siRNA組與TGF-β1刺激組之間E-cadherin、HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，HMGA1、α-SMA表達均顯著高于對照組(P<0.05)，E-cadherin表達顯著低于對照組(P<0.05)。與TGF-β1刺激組及TGF-β1+NC-siRNA組相比較，TGF-β1+HMGA1 siRNA組中HMGA1、α-SMA的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降(P<0.05)，E-cadherin表達水平顯著增高(P<0.05)。Western blot檢測結果與半定量RT-PCR檢測一致，見圖3、4。

M：Marker；1：正常對照組；2：空白對照組；3：陰性對照組；4：HMGA1-siRNA-1組；5：HMGA1-siRNA-2組；6：HMGA1-siRNA-3組；*：P<0.05；**：P<0.01，與正常對照組、空白對照組、陰性對照組比較。

圖1半定量RT-PCR檢測HMGA1 siRNA轉染LX-2

細胞48 h后HMGA1的mRNA表達

1：正常對照組；2：空白對照組；3：陰性對照組；4：HMGA1-siRNA-1組；5：HMGA1-siRNA-2組；6：HMGA1-siRNA-3組；*：P<0.05；**：P<0.01，與正常對照組、空白對照組、陰性對照組比較。

圖2Western blot檢測HMGA1 siRNA轉染LX-2細胞

48 h后HMGA1的蛋白表達情況

M：MarkerⅠ；1：對照組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1+NC-siRNA組；4：TGF-β1+HMGA1-siRNA組；*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組比較。

圖3　HMGA1 siRNA對經過TGF-β1刺激后的LX-2細胞

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NCsiRNA組比較。

2.3轉染HMGA1-siRNA后LX-2細胞增殖活力的變化TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組所測得A值與對照組相比顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組間差異無統計學意義(P>0.05)；TGF-β1+HMGA1-siRNA組的A值與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組相比顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

1：對照組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1+NC-siRNA組；4：TGF-β1+HMGA1-siRNA組;*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與TGF-β1刺激組和TGF-β1+NC-siRNA組比較。

圖4HMGA1-siRNA對經過TGF-β1刺激后的LX-2細胞

中HMGA1、α-SMA、E-cadherin mRNA和蛋白表達

3討論

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是指成熟的上皮細胞經歷了短暫結構改變，同時細胞表型發生改變，失去部分上皮細胞用以維持細胞極性及形態，同時表達間充質細胞標記蛋白如波形蛋白、α-SMA、成纖維細胞特異性蛋-1等，細胞遷移與侵襲能力增強，而細胞間黏附力減弱，同時可獲得抗凋亡和降解細胞外基質的潛能[6-7]。EMT在促進癌細胞轉移、創傷愈合及器官纖維化[8-9]的過程中擔當重要角色。上皮組織來源的腫瘤細胞可經EMT過程實現其在體內的侵襲和轉移行為，使細胞獲得更加適合于在細胞外環境中運動和遷移的表型。早期阻斷某些誘導2型EMT的配體可以逆轉上皮細胞表型轉化。研究發現靜息性HSC、肝細胞和膽管上皮細胞都能經EMT轉化為肌成纖維細胞，這表明肝實質上皮細胞也參與了肝纖維化進程[10-11]。因此，EMT過程在肝纖維化的發生、發展中可能起一定作用。

資料表明，染色質的核骨架結合序列(MARs/SARs)處，HMGA1可取代組蛋白H1，進而活化染色質的轉錄[12]。HMGA1并不直接參與轉錄，而是促使其他轉錄因子結合、聚集，調節轉錄起始過程[13]。正常情況下，HMGA1在分化成熟的組織中幾乎不表達，而主要存在于胚胎發育期及快速增殖的細胞內[14]。HMGA1基因生物學行為類似癌基因，位于許多腫瘤細胞染色體斷裂點簇集區，在轉錄水平抑制許多基因的表達。許永華等[15]研究發現，HMGA1基因和腫瘤的肝內轉移相關，其在肝細胞癌中的表達顯著高于正常肝組織。筆者探討HMGA1通過EMT參與了肝纖維化發展。

本課題實驗結果表明，TGF-β1作用于LX-2對HMGA1基因表達有上調作用，且靶向HMGA1的siRNA能沉默LX-2細胞中HMGA1的表達，且以HMGA1-siRNA-1組的沉默效果最佳。干擾HMGA1基因可顯著抑制TGF-β1對HMGA1、α-SMA 基因和蛋白表達的誘導作用；同時也可抑制TGF-β1誘導LX-2增殖水平的升高，減輕對E-cadherin表達的抑制作用，提示其參與了TGF-β1誘導的肝星狀細胞活化。

綜上所述，HMGA1基因在以星狀細胞活化為中心的肝纖維化進程中發揮了重要作用。本課題為HMGA1在肝纖維化中的重要作用提供了直接的理論依據。未來研究重點將轉向動物實驗，如何將其導入體內并確保其有效性、安全性等諸多方面的問題有待進一步的探索。抑制HMGA1的表達有望成為臨床防治肝纖維化的一個新靶點。

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Effects of siRNA inhibit HMGA1 gene expression on LX-2 cell biological functions*

Hu Lei,Liu Li,Zhang Shuang,Du Fangteng△,Zhang Jixiang

(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity/KeyLaboratoryofMolecularMedicineofJiangxiProvincial,Nanchang,Jiangxi330006,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of siRNA mediated HMGA1 silence on proliferation and the gene expression of HMGA1,α-SMA and E-cadherin in activated hepatic stellate cells and its mechanisms.MethodsSynthetic HMGA1 siRNA was transfected into LX-2 cells to silence the HMGA1 gene.The expression level of HMGA1,α-SMA and E-cadherin was determined by RT-PCR and Western blot experiments.LX-2 cell proliferation was assessed by MTT assay.ResultsThe best inhibited effect was HMGA1-siRNA-1.Compared with control group,the cell proliferation and the mRNA and protein expression of HMGA1,α-SMA in TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group were significantly increased (P<0.05),without significant differences between the two groups (P>0.05),while the expression of E-cadherin in TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group were significantly decreased compared with control group (P<0.05).Meanwhile,the cells in TGF-β1+HMGA1 siRNA group showed significantly decreased proliferation level,down-regulated mRNA and protein expression of HMGA1,α-SMA but up-regulated expression of E-cadherin compared with TGF-β1 group and TGF-β1+NC-siRNA group(P<0.05).ConclusionHMGA1 interference could significantly down-regulate the expression of HMGA1 in LX-2 cells cultured with TGF-β1,thus inhibiting the proliferation and activation of the cells．

[Key words]high mobility group AT-hook 1;RNAi;hepatic stellate cell LX-2;liver fibrosis

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.006

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81360074)。

作者簡介：胡蕾(1987-)，碩士，主要從事消化系統疾病的研究。△通訊作者，Tel:1360708280；E-mail:jixiangz@tom.com。

[中圖分類號]R575.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2323-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-02-22)