NGAL及MMP9在原發性肝癌患者血清中表達及意義

唐成佳,余天霧

(重慶醫科大學附屬永川醫院肝膽外科，重慶永川 404000)

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NGAL及MMP9在原發性肝癌患者血清中表達及意義

唐成佳,余天霧△

(重慶醫科大學附屬永川醫院肝膽外科，重慶永川 404000)

[摘要]目的探討原發性肝癌(PHC)患者血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)及基質金屬蛋白酶9(MMP9)的變化及臨床意義。方法采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測47例PHC患者(PHC組)及19例健康體檢者健康血清中NGAL及MMP9水平，并分析二者與臨床病理的聯系，同時使用ROC曲線分析二者對PHC的診斷價值，Kaplan-Meier生存曲線分析不同NGAL、MMP9水平的生存差異。結果PHC組NGAL、MMP9水平明顯高于健康體檢者對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；NGAL及MMP9的水平在Ⅲ～Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統計學意義(P<0.05)；血清 MMP9、NGAL檢測靈敏度分別為 70.2%和83.0%。二者聯合檢測可提高靈敏度至94.9%。Kaplan-Meier生存分析發現血清NGAL水平高患者預后差。結論PHC患者血清NGAL及MMP9與PHC的發生、發展密切相關；聯合檢測血清水平NGAL及MMP9可明顯提高敏感度，對PHC診斷及預后指標有一定的價值。

[關鍵詞]原發性肝癌;中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白;基質金屬蛋白酶9

原發性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)是指肝內原發而非轉移的肝臟惡性腫瘤。PHC發生率占全部惡性腫瘤的5%,世界范圍內每年大約100萬人受PHC的影響,其病死率與患病率幾乎相同。中國是PHC的發病率高的地區之一,達到全球的50%以上,PHC的病死率高,病死率及患病率均排在消化系惡性腫瘤的第2位,術后5年生存率平均僅為20%左右。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)是Kjeldsenl等[1]于1993年在研究人中性粒細胞中基質金屬蛋白酶9(MMP9)時發現的，屬于Lipocalin家族成員。近年來研究發現，NGAL與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結腸癌的發生、發展有關，在上述腫瘤中均發現NGAL高表達且與腫瘤浸潤、轉移或預后有關。而NGAL在肝癌中的表達情況，國內外鮮見相關報道，本研究采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測肝癌患者血清中NGAL及MMP9的表達情況，并分析二者與臨床病理的聯系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2009年3月至2010年3月在本院肝膽外科就診的47例PHC患者(PHC組)的血清，其中男24例，女23例，年齡40～85歲，平均年齡63.2歲,高分化17例，低分化30例，均在術前收集，所有診斷均經病理切片證實；同時收集本院體檢科19例健康體檢人員血清作為健康對照組，所有入組人員均告知檢查目的，并簽署知情同意書。PHC的診斷符合中國抗癌協會肝癌專業委員會修訂的PHC的臨床診斷與分期標準。采用一次性無菌肝素化的玻璃試管收集每位入組病例晨起空腹靜脈血 3 mL，3 000 r/min×10 min，取上清液分裝于無菌玻璃試管中置于-70 ℃冰箱中凍存備用。

1.2主要試劑人 NGAL ELISA 檢測試劑盒、人MMP9 ELISA試劑盒均購于武漢博士德公司；酶標儀購于Thermo公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測PHC患者血清NGAL、MMP9表達ELISA檢測參照試劑盒說明書進行。從-80 ℃冰箱中取出待測血清標本，室溫下解凍，配置標準品，加樣，37 ℃溫育30 min。洗滌液充分洗滌 4～6 次，加酶，37 ℃溫育 30 min，洗滌4～6 次，加入顯色劑 A 及B 液各 50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液，以空白孔調零，終止后 15 min內， 于酶標儀中405 nm 波長測量各孔的吸光度(OD)值，并繪制標準曲線，計算各待測孔中樣品濃度。

2結果

2.1兩組血清NGAL及MMP9水平比較PHC組NGAL、MMP9水平為(31.9±9.0)ng/mL、(336.1±85.7)ng/mL明顯高于健康對照組(18.0±8.6)ng/mL、(190.0±62.4)ng/mL，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2PHC患者血清NGAL及MMP9表達與臨床病理的聯系隨著PHC TNM分期的增加，NGAL及MMP9的表達率也逐漸增加，NGAL及MMP9的水平在Ⅲ～Ⅳ期為(33.6±7.8)ng/mL、(357.5±85.2)ng/mL，高于Ⅰ～Ⅱ期(27.4±8.4)ng/mL、(291.2±82.4)ng/mL，差異有統計學意義(P<0.05)；NGAL及MMP9的水平與患者的年齡、性別、腫瘤發生部位及腫瘤大小、分化程度等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3ROC曲線分析血清MMP9和NGAL的曲線下面積分別為0.890和0.864，血清MMP9對PHC診斷價值略高于NGAL。血清MMP9最佳臨界值為268.50 ng/mL，靈敏度和特異度分別為70.2%和94.7%；血清NGAL最佳臨界值為24.50 ng/mL，靈敏度和特異度分別為83.0%和78.9%。聯合檢測受試者血清MMP9和血清NGAL 中任一檢測結果為陽性即為患者。聯合檢測可提高靈敏度至94.9%，但特異度降低至74.7%。

圖1　不同血清NGAL水平的PHC患者的生存曲線

2.4生存分析對47例PHC患者進行5年隨訪調查，以血清NGAL≥24.50 ng/mL，MMP9≥268.50 ng/mL為陽性；血清中NGAL<24.50 ng/mL，MMP9<268.50 ng/mL為陰性。進行Kaplan-Meier生存分析，MMP9、NGAL陽性組及陰性組患者的中位生存期分別為22.0、37.0個月。生存曲線顯示NGAL陽性表達者的生存時間明顯低于陰性表達(P<0.05)，而MMP9水平與患者生存時間無明顯相關性(P>0.05)，見圖1、2。

圖2　不同血清MMP9水平的肝癌患者的生存曲線

3討論

我國是世界上的肝癌大國,肝癌患者總數占世界肝癌患者的55%[2]，其病死率達26.26/100 000。腫瘤的侵襲和轉移是導致患者死亡的重要原因。

腫瘤發生侵襲轉移細胞外基質的降解是首要條件。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組能夠降解細胞外基質和基底膜成分的重要蛋白水解酶， MMP9又稱明膠酶B(gelatinaso B) 作為MMPs家族中的重要一員。可與 MMP9 形成復合物，拮抗 TIMP-1 對 MMP9 的抑制作用，從而增加 MMP9 的活性，促進對細胞外基質的降解。此外，MMP9還可以促使血管內皮生長因子(VEGF)釋放，增加腫瘤血管生成，促進腫瘤侵襲轉移[3-4]。本研究發現，血清中MMP9水平在PHC組明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05),且與腫瘤的臨床分期密切相關，說明MMP9在腫瘤發生、發展中起著重要作用。

NGAL是在研究 MMP9 時發現的小分子蛋白，屬于脂質運載蛋白超家族[1]，其基因定位于染色體 9q34 上，全長為5 869 bp，其中包括 1 659 bp 的 5′端非轉錄區，178 bp 的 3′端非轉錄區，以及3 696 bp 的原初轉錄區[5]。NGAL 蛋白具有脂質運載蛋白家族的典型β-折疊桶(β-barrel)結構，它由連續氫鍵連接的8段反向平行的 β 折疊鏈構成的，其封閉端的 β4～β5環上有游離的硫基(C87)，可與 MMP9 等蛋白分子形成二硫鍵，形成異源二聚體，再與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)形成 NGAL/MMP9/TIMP-1 三元復合物，從而調節MMP9等分子的活性[6]。

近年研究發現，NGAL與多種腫瘤如胃癌、乳腺癌、結腸癌的發生、發展有關。Zhang等[7]已使用免疫組織化學法檢測了138例肝癌患者組織中NGAL及其受體的表達。發現肝癌患者組織中NGAL及受體表達明顯高于癌旁組織，二者表達與腫瘤的不良預后密切相關。Wang等[8]也發現胃癌組織中NGAL表達明顯高于正常癌旁組織，其表達與腫瘤大小、Lauren′s 分級、淋巴結轉移及血管浸潤有關。而也發現患者血清中NGAL表達與臨床病理分期有關，同時發現血清中NGAL表達比CA199和CEA更具有標志性，與患者預后更相關。而結直腸腫瘤NGAL基因的表達是否參與腫瘤浸潤、轉移尚不明確，Hu等[9]認為，NGAL可通過MMP9依賴及非MMP9依賴(鐵依賴減少E-cadherin)的機制，減弱細胞間黏附，促進腫瘤血管形成、浸潤和遠處轉移。本研究發現，血清中NGAL水平與臨床病理分期密切相關，提示NGAL可能參與了腫瘤的浸潤與轉移，但也有人發現NGAL高表達于結腸癌組織中，但其淋巴結轉移灶卻未見表達，認為NGAL在轉移過程中作用可能沒有發揮主要作用[10]， 在體外試驗中，異常表達的NGAL可抑制結腸癌細胞的浸潤及肝轉移[11]，NGAL可能不能作為腺瘤癌變的標志物[12]。

本研究提示，PHC組NGAL及MMP9水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。Ⅲ～Ⅳ期NGAL、MMP9水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，經長期隨訪調查顯示，血清中NGAL陽性的肝癌患者的生存率低于NGAL陰性的PHC患者，NGAL陽性患者的中位生存期明顯低于NGAL陰性，提示血清中NGAL水平與患者的預后密切相關。血清MMP9水平與患者生存時間無明顯相關性，可能與樣本量偏小有關。ROC分析得出，單獨檢測血清NGAL、MMP9水平，其敏感度均較低，二者聯合檢測可明顯提高其敏感度，而其特異度有所下降，可能由于血清 MMP9 和 NGAL 可在多種腫瘤中異常表達，故缺乏對于PHC特異性，但二者作為診斷及判斷PHC預后的指標仍有一定的價值。

參考文獻

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Detection of peripheral NGAL and MMP9 levels and its clinical significance in primary hepatic carcinoma

Tang Chengjia,Yu Tianwu△

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedYongchuanHospitalofChongqingMedicalUniversity,Yongchuan,Chongqing404000,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the changes of matrix metalloproteinase 9(MMP9) and neutrophil gelatinase associated lipocalin(NGAL) in primary hepatic carcinoma and its clinical significance.MethodsEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the serum level of MMP9 and NGAL in 47 patients with primary hepatic carcinoma and 19 healthy controls.The association between serum MMP9 and NGAL levels with the clinicopathological features of hepatic carcinoma were evaluated.ROC curves were used to analyze the influence of MMP9 and NGAL on the diagnostic value.Kaplan-Meier method was used to evaluate the relationship between the expressions of NGAL and MMP9 and the prognosis of patients with HCC.ResultsSerum MMP9 and NGAL levels in hepatic carcinoma patients are significantly higher compared with normal controls(P≤0.05).The serum level of MMP9 and NGAL in primary hepatic carcinoma was positively correlated with TNM stage(P≤0.05).The sensitivity and specificity of MMP9 and NGAL for primary hepatic carcinoma were 70.2% and 83.0%.The sensitivity of the joint detection were 94.9%.Kaplan Meier survival curves showed that cumulative survival rates of patients with positive expression of NGAL were significantly lower than those of patients with negative expression.ConclusionMMP9 and NGAL might play an important role in gastric cancer generation and development.Monitoring of serum MMP9 and NGAL levels might be helpful for diagnosis and evaluation of prognosis for primary hepatic carcinoma.

[Key words]primary hepatic carcinoma;NGAL;matrix metalloproteinase 9

作者簡介：唐成佳(1985-)，住院醫師，碩士，主要從事肝臟腫瘤研究。△通訊作者，Tel:13996104299;E-mail:ytw0000@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.017

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2357-03

(收稿日期：2015-12-12修回日期：2016-02-02)