HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌中的表達及臨床意義

王　金，趙一潔，崔廣賓，尚培中△

(1.中國人民解放軍第二五一醫院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學院，石家莊 075061)

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HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌中的表達及臨床意義

王金1，趙一潔2，崔廣賓2，尚培中1△

(1.中國人民解放軍第二五一醫院普通外科，河北張家口 075000；2.河北北方學院，石家莊 075061)

[摘要]目的探討肝細胞生長因子(HGF)與其受體(C-Met)蛋白在血清及組織中的表達及臨床意義。方法采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測42例初治膽管癌患者及20例健康對照者血清HGF及C-Met水平；應用免疫組織化學技術觀察42例膽管癌組織及正常組織HGF及C-Met的表達。結果術前1 d膽管癌患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平均高于健康對照者(1.53±0.48)ng/mLvs.(0.48±0.55)ng/mL;(16.28±5.17)ng/mLvs.(4.31±2.84)ng/mL,差異均有統計學意義(P<0.05)。術后第3天膽管癌患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術前變化不明顯，而術后第7、10天HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術前則明顯降低。另外，HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌組織的陽性表達率分別為76.2%、81.0%，在正常組織的表達分別為15.0%、20.0%。結論HGF蛋白與C-Met蛋白在膽管癌患者血清和組織中異常表達，可能與膽管癌的發生、發展有密切關系。

[關鍵詞]膽管腫瘤；肝細胞生長因子；C-Met蛋白；臨床病理特征

膽管癌(cholangiocarcinoma)是指起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，惡性程度高、預后差，根治性手術切除后患者的5年生存率也僅為20%～40%[1]。膽管癌細胞強大的局部侵犯和遠處轉移能力是膽管癌預后極差的兩大主要危險因素。目前，膽管癌治療效果欠佳,預后較差,逐步提升為臨床研究重點之一[2]。隨著生命科學及分子生物學的發展，與腫瘤轉移有關的分子機制逐漸被人們發現。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其受體(C-Met)蛋白在人類腫瘤的發展及轉移中有重要作用，但目前對于HGF和C-Met蛋白的研究還主要集中在胃癌、肝癌、肺癌等領域，在膽管癌中還鮮有報道[3-4]。本研究檢測了健康者和膽管癌患者血清中HGF和C-Met蛋白的水平，并且對正常組織和膽管癌組織中HGF和C-Met蛋白的表達情況進行了分析，探討HGF和C-Met蛋白在膽管癌中的表達和臨床意義。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年12月至2015年3月本院普外科收治的膽管癌患者42例(膽管癌組)，男25例，女17例，年齡36～78歲，平均(59.6±13.0)歲。全部患者均接受準根治性切除手術。腫瘤大小0.4～3.8 cm。中低分化19例、高分化23例。根據2010年美國國家癌癥綜合網(NCAA)第7版TNM分期標準進行分類：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期20例。另選取同期健康對照者膽管正常組織20例(健康對照組)，術后存檔蠟塊經EliVisionTMplus免疫組織化學染色后光鏡觀察。

1.2實驗試劑人HGF及C-Met 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國Genzyme公司；兔抗人HGF和C-Met單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；EliVisionTMplus二步法試劑盒購自福州邁新生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1研究方法所有患者均于入院后術前1 d，術后第3、7、10天采集靜脈血3 mL，室溫下靜置10 min后，4 ℃下2 500 r/min離心10 min收集血清保存于-80 ℃冰箱。使用人HGF ELISA試劑盒檢測各樣本HGF水平，檢測步驟嚴格按照說明書進行。根據微波(microwave，MW)熱效應原理，采用MW抗原修復EliVisionTMplus二步免疫組織化學染色方法，每例連續切片進行HGF和C-Met標記，每種免疫組化標記的切片染色2張，其中1張DAB顯色后蘇木素復染用于觀察和照相，另一張不復染，用于圖像分析。每次用已知HGF和C-Met陽性標本切片作為陽性對照。以磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液代替一抗做空白對照，以排除假陽性結果。

1.3.2結果判定HGF蛋白陽性著色主要位于腫瘤細胞和間質細胞胞質及細胞膜，C-Met蛋白陽性著色主要位于腫瘤細胞質及細胞膜。結果的判定遵循雙盲法,由2名病理醫師獨立觀察。染色判定結果標準：隨機觀察并計數10個高倍鏡(×400)視野下的陽性細胞，根據細胞染色強度及陽性細胞數占同類細胞總數的百分率綜合判定。

2結果

2.1膽管癌術前、術后及健康對照組血清中HGF及C-Met水平比較膽管癌組患者術前1 d血清中HGF及C-Met蛋白的表達明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。術后第3天膽管癌組患者血清中HGF蛋白與C-Met蛋白水平較術前變化不明顯，而術后第7、10天HGF蛋白與C-Met蛋白的水平較術前則明顯降低，甚至達到正常水平。

表1　膽管癌及健康對照組術前、術后血清中

*：P<0.05：與健康對照組比較；#：P<0.05，與膽管癌組術前1 d比較。

2.2HGF及C-Met蛋白在膽管癌組織及正常膽管組織中的表達HGF及C-Met蛋白在大部分細胞質內出現棕色陽性表達(圖1、2)，膽管癌組的陽性表達率明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　HGF及C-Met的在膽管癌組織及正常

A：HGF在正常膽管組織中的表達；B：HGF在膽管癌組織中的表達。

圖1HGF蛋白的表達情況(Envision，×100)

2.3HGF及C-Met蛋白在膽管癌組織表達與臨床病理特征的關系HGF蛋白的表達與淋巴結轉移、分化程度及TNM分期有關，差異有統計學意義(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤大小等其他因素無關，差異無統計學意義(P>0.05)。C-Met蛋白的表達與TNM分期、淋巴結轉移有關，差異有統計學意義(P<0.05)；而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度等其他因素無關，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

A：C-Met在正常膽管組織中的表達；B：C-Met在膽管癌組織中的表達。

圖2　C-Met蛋白的表達情況(Envision，×100)

3討論

膽管癌已成為臨床較為常見的惡性腫瘤，早期發病無明顯臨床癥狀，國內流行病學資料證實膽管癌的發生率和病死率逐漸增加，導致這種現象的主要原因是缺乏有效的診斷和治療手段。膽管癌并無特異性的腫瘤標志物，僅CA19-9、CA125、癌胚抗原(CEA) 有一定價值，但是這些腫瘤標志物沒有較高的特異度與靈敏度[5]。隨著腫瘤分子生物學研究的逐漸深入,學者們發現表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、HGF、IL-6等能促進膽管細胞DNA合成[6-8]。HGF是一種多功能細胞因子,盡管其結構、基因序列等已明確,但其在膽管癌中發揮作用的具體機制尚不完全清楚。基礎研究表明，HGF具有促有絲分裂活性,可以促進膽管癌的轉移，但臨床上關于HGF對膽管癌的影響的報道卻很少見[9]。C-Met是從NIH3T3 細胞中克隆出來的一種原癌基因，屬于酪氨酸激酶家族的成員，也是HGF惟一的受體。目前已經證實C-Met 參與了多種惡性腫瘤的發生，并且有文獻報道C-Met也參與膽管癌的發生過程[10-12]。因此，本研究期望通過檢測血清中HGF蛋白與C-Met蛋白的水平及在膽管癌組織中的表達，探討其具有的臨床意義。

本研究發現，膽管癌患者血清中HGF的水平較健康人明顯升高，這與國外學者Balaban等[13]的研究較為相似。據此，筆者檢測了HGF在膽管癌組織中的表達，發現HGF蛋白的表達與淋巴結轉移、分化程度及TNM分期相關，與性別、年齡、腫瘤大小等其他因素無關；C-Met蛋白的表達與TNM分期、淋巴結轉移相關，而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關。

有研究表明，HGF/C-Met不僅可以調節腫瘤細胞間的黏附作用、促進細胞外基質的降解，還可以促進腫瘤血管生成。有文獻表明，HGF/C-Met可能影響膽管癌的預后[14]。

為了研究HGF/C-Met與膽管癌預后的關系，筆者檢測了膽管癌患者術后第3、7、10天血清中HGF及C-Met的水平，我們發現，術后第3天血清中HGF及C-Met的水平較術前并未明顯下降，但在第7、10天膽管癌患者血清中HGF及C-Met的水平明顯下降，甚至達到正常水平。因此，筆者認為血清中HGF及C-Met的水平對預測膽管癌的復發及轉移具有一定的參考價值。

綜上所述，本研究結果表明HGF及C-Met在膽管癌患者血清和組織中呈高度活化，其活化對維持膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力起重要作用。本研究認為深入認識 HGF及C-Met 在膽管癌進展中的作用可以為開發膽管癌的分子靶向治療提供實驗依據。

參考文獻

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Expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma

Wang Jin1,Zhao Yijie2,Cui Guangbin2,Shang Peizhong1△

(1.DepartmentofGeneralSurgery,the251thHospitalofPeople′sLiberationArmy,Zhangjiakou,Hebei075000,China;2.NorthernCollegeofHebei,Zhangjiakou,Hebei075061,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma.MethodsThe levels of HGF and C-Met were measured by ELISA,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma and health control was detected by immunohistochemistry.ResultsThe preoperative levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma were higher than the health control(P<0.05).Compared with the preoperative state,the levels of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma on the 3rd day after operation did not change significantly.However,the levels of HGF and C-Met on the postoperative 7th and 10th day decreased obviously.In addition,the expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma was 76.2%,81.0%,respectively,which is higher than that in normal tissue(P<0.01).ConclusionThere is an abnormal expression of HGF and C-Met in cholangiocarcinoma,which may be related to the incidence and development of cholangiocarcinoma.

[Key words]cholangiocarcinoma;hepatocyte growth factor;C-Met;clinical and pathological features

作者簡介：王金(1986-)，主治醫師，本科，主要從事肝膽外科方向研究。△通訊作者，Tel:18903138087；E-mail:spz251@163.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.019

[中圖分類號]R735.8

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2362-03

(收稿日期：2015-11-22修回日期：2016-01-10)