胰島素抵抗和單硝酸異山梨酯對SHR心肌細胞凋亡的影響

白　冰，葛龍菲，田晨光△

(1.鄭州大學第二附屬醫院內分泌科，鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫院內分泌科，鄭州 450000)

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胰島素抵抗和單硝酸異山梨酯對SHR心肌細胞凋亡的影響

白冰1，葛龍菲2，田晨光1△

(1.鄭州大學第二附屬醫院內分泌科，鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫院內分泌科，鄭州 450000)

[摘要]目的觀察胰島素抵抗(IR)和單硝酸異山梨酯(ISMN)對自發性高血壓大鼠(SHR)心肌細胞凋亡的影響。方法14周齡雄性Wistar大鼠(W)和SHR(S)各40只，分別或聯合喂飼普通飼料(普)、高脂高糖(HFHG)飼料及生理鹽水(NS)和ISMN灌胃。將其分為普+NS組(W 普和S普)，HFHG +NS組(W高和S高)，普+ISMN組(W單和S單)，HFHG+ISMN組(W高單和S高單)，每組各10只。喂養12周，取頸動脈血檢測血糖及血清胰島素水平并計算IR指數(HOMA-IR)；取心肌組織4份，分別觀察光鏡下形態、組織中一氧化氮(NO)水平，bcl-2、bax基因及其蛋白的表達情況。結果心肌NO水平、bax基因 mRNA及相關蛋白表達水平，在給予HFHG和ISMN干預的各組均高于普通組，bcl-2基因mRNA及相關蛋白表達反之；S組大鼠心肌組織NO水平、bax基因 mRNA及相關蛋白表達均較相應的W組增多，bcl-2基因mRNA及相關蛋白表達反之；W高組大鼠心肌組織NO水平與HOMA-IR呈顯著正相關，W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平與呈正相關。結論SHR心肌細胞凋亡較Wistar大鼠增多，ISMN、IR均能加重SHR心肌細胞凋亡，且ISMN與IR互相誘導、互為因果。

[關鍵詞]大鼠，近郊SHR；胰島素抵抗；單硝酸異山梨酯；細胞凋亡

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)是多種代謝異常發生在同一個體的臨床狀態，以胰島素抵抗胰島素抵抗(insulin Resistance，IR)為基礎及中心環節[1]，以高血壓、糖尿病、脂代謝紊亂等為組分，這些組分之間互有協同作用，可直接促進動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerosis cardiovascular disease，ASCVD)的發生和發展，如心肌缺血、心肌細胞凋亡等。但具體作用機制，如IR是否可直接導致和(或)加重由高血壓直接引起的心肌凋亡等，尚未完全明確。目前ASCVD的治療多依賴藥物，其中常用藥物為硝酸酯類如單硝酸異山梨酯(isosorbide mononitrate，ISMN)，后者通過提供外源性一氧化氮(NO)發揮作用。但有研究發現，NO有誘導細胞凋亡的作用，而ISMN會否通過提供NO加劇高血壓大鼠心肌細胞凋亡，目前研究較少。本文分別通過誘導自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)IR狀態和飼喂ISMN，來探究IR、ISMN對SHR心肌細胞凋亡的影響，以期從IR的角度解釋高血壓心肌細胞凋亡，并質疑高血壓患者長期應用ISMN的安全性。

1材料與方法

1.1材料動物：選擇14周齡雄性Wistar大鼠(河南省實驗動物中心)和SHR(北京聯合利華實驗動物有限公司)各40只，體質量(393.75±11.09)g；普通飼料配方為：蛋白質：脂肪：碳水化合物比值為：9∶2∶24，購自河南省實驗動物中心；高脂高糖(HFHG)配方為：普通飼料79%，蔗糖10%，豬油5%，膽固醇5%，石膽酸1%。ISMN片，購自魯南貝特制藥有限公司，規格為：片劑 20 mg×48片。

1.2方法

1.2.1動物分組及干預措施將80只大鼠隨機分為W普、W高、W單、W高單組和S普、S高、S單、S高單組，每組10只。W普和S普組飼喂普通飼料和NS，W高和S高組飼喂HFHG和NS，W單和S單組飼喂普通飼料和ISMN，W高單和S高單組飼喂HFHG和ISMN。其中，ISMN按4.20 mg/kg劑量灌胃。

1.2.2動脈血葡萄糖、胰島素水平測定及IR指數(HOMA-IR)的計算上述方法喂養12周。禁食不禁水12 h后麻醉大鼠，取頸動脈血1 mL，離心后取上層血清，置于-20 ℃冰箱，用于檢測空腹血糖(FBP，葡萄糖氧化酶法)及空腹胰島素(FINS，放射免疫法)水平。取自然對數表示，使其成正態分布，其中FBG的單位是mmol/L，FINS的單位是mIU/L。HOMA-IR的計算公式如下：

HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

1.2.3測定心肌組織中NO水平和bcl-2、bax基因及蛋白表達取血結束后，在冰面工作臺上處死大鼠，開胸取出心臟，冰水沖洗后在心底部各取約100 mg全層心肌組織共4份。其中，1份放入4%甲醛溶液中，原位缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)觀察心肌形態，另外3份均迅速放入液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存，分別各自采用硝酸還原酶法測定NO，RT-PCR法測定bcl-2與bax mRNA表達水平，Western blot法測定bcl-2與bax蛋白表達量。

2結果

2.1各組大鼠HOMA-IR比較W高、W單、W高單組HOMA-IR均較W普組高，差異有統計學意義(P<0.05)。S高、S單、S高單組HOMA-IR均較S普組高，差異有統計學意義(P<0.05)。S組大鼠HOMA-IR高于相應W組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　　各組大鼠HOMA-IR比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應W組比較。

2.2各組大鼠心肌組織中NO水平比較W高、W單、W高單組大鼠較W普組高，差異有統計學意義(P<0.05)。S高、S單、S高單組大鼠較S普組高，差異有統計學意義(P<0.05)。S組大鼠心肌組織NO水平均高于相應W組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)。S高單組大鼠心肌組織NO水平高于S高、S單組大鼠，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2　　各組大鼠心肌組織中NO水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應W組比較。

2.3W高、W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平的相關性分析W高、W單組心肌組織NO水平與HOMA-IR呈正相關(r=0.90、P<0.01，r=0.74，P<0.05)，見圖1。

圖1　W高、W單組大鼠HOMA-IR與心肌組織NO水平的相關性分析散點圖

圖2　各組大鼠凋亡心肌細胞TUNEL 染色切片光鏡下圖像(×400)

2.4各組大鼠心肌形態學觀察W高、W單、W高單組大鼠每高倍視野心肌細胞凋亡多于W普組大鼠(P<0.05)。S高、S單、S高單組大鼠每高倍視野心肌細胞凋亡多于S普組大鼠(P<0.05)。S組大鼠每高倍視野心肌細胞凋亡多于相應W組大鼠(P<0.05)，見表3。各組大鼠TUNEL 染色切片在光鏡下可以觀察到凋亡心肌細胞的細胞核被染成棕黃色，正常細胞核不染色。各組大鼠心肌組織中均存在一定數量的凋亡細胞(箭頭所示)。經HFHG飲食和(或)ISMN藥物干預的大鼠凋亡增多，SHR凋亡總體多于Wistar大鼠，見圖2。

表3　　各組大鼠心肌凋亡細胞數比較±s，每高倍視野)

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應W組比較。

2.5各組大鼠心肌組織bcl-2與bax mRNA表達比較心肌組織bcl-2 mRNA表達水平，W高、W單、W高單組大鼠均低于W普組(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均低于S普組(P<0.05)；S組大鼠心肌組織bcl-2 mRNA表達水平均低于相應W組大鼠(P<0.05)。心肌組織bax mRNA表達水平，W高、W單、W高單組大鼠均較W普組高(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均較S普組高(P<0.05)。S組大鼠心肌組織bcl-2 mRNA表達水平均高于相應W組大鼠(P<0.05)，見表4及圖3。

表4　　各組大鼠心肌組織中bcl-2與bax mRNA表達水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應W組比較，P<0.05。

圖3　各組大鼠bcl-2、bax基因PCR分析結果

2.6各組大鼠心肌組織bcl-2與bax蛋白表達水平心肌組織bcl-2蛋白表達水平，W高、W單、W高單組大鼠均低于W普組(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均低于S普組(P<0.05)。S組大鼠心肌組織bcl-2蛋白表達水平均低于相應W組大鼠(P<0.05)。大鼠心肌組織bax蛋白表達水平，W高、W單、W高單組大鼠均較W普組高(P<0.05)；S高、S單、S高單組大鼠均較S普組高(P<0.05)。S組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達水平均高于相應W組大鼠(P<0.05)，見表5及圖4。

表5　　各組大鼠心肌組織中bcl-2與bax蛋白表達水平比較

a：P<0.05，與同種大鼠普組比較；b：P<0.05，與相應W組比較。

圖4　　各組大鼠bcl-2、bax蛋白表達

3討論

NO是近年來的研究熱點之一，它在舒張血管、氧化應激、炎癥反應等過程中發揮著重要作用。在本研究中，SHR心肌組織中NO水平高于普通大鼠，這與目前所認為的高血壓時血液中NO減少的結果不一致，或許是機體為保持血壓處于較低水平而做出的代償反應[2]。為拮抗高血壓狀態，SHR體內蛋白偶聯亞硝鐵復合物(DNIC)合成會增多，其或許可通過與非血紅素鐵反應，來提高血中NO水平[3]。另外，也有研究觀察到SHR心臟內皮細胞中一氧化氮合酶(NOS)Ⅲ作用增強[4]，及主動脈中NOS Ⅱ的基礎表達增多[5-6]。

本研究數據顯示，應用ISMN后，SHR心肌細胞凋亡增多。可能的原因是：(1)飼喂12周后，SHR大鼠合成NO能力或許尚能代償，但釋放NO入血液的能力減弱，從而使較多的NO積聚于組織細胞中；(2)長期應用ISMN可增加氧自由基生成[7]，后者造成心肌細胞損傷；(3)體內過多的NO通過環磷酸鳥苷(cGMP)通路介導心肌細胞凋亡，同時可與超氧陰離子反應生成過氧亞硝基，造成心肌損害[8-9]。

作為MS的基礎，IR可直接促進動脈粥樣硬化，但其是否可直接引起心肌細胞凋亡尚未知。本研究發現，經HFHG干預的Wistar大鼠和SHR心肌細胞凋亡分別多于普通飲食的同種大鼠，且心肌凋亡明顯增多的飲食和(或)藥物干預組大鼠均伴有較嚴重的IR，這說明IR或許是引起細胞凋亡的因素之一。有研究發現，IR引起的氧化應激、炎癥、內皮細胞功能紊亂、代謝失衡、離子內環境異常和間質纖維化等可直接導致心肌損傷，如梗死、凋亡等[10-13]。而在損害血管方面，IR狀態下許多炎性因子如C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)等增多，同時，IR及其伴隨的高胰島素血癥促進動脈壁脂質攝取，防止膽固醇清除，以上因素均可促進動脈壁平滑肌細胞增殖，誘發并加劇動脈粥樣硬化，從而導致心肌缺血、凋亡。另外，IR可直接引起高血壓，從而加劇IR大鼠心肌細胞凋亡。但目前尚無IR導致高血壓的具體解釋，多數認為IR繼發性高胰島素血癥能使腎臟水鈉重吸收增強，交感神經系統活性亢進，動脈彈性減退，從而使血壓升高。

在MS患者，IR與高血壓常合并存在，二者具有協同作用。如本研究所見，MS患者常用藥物ISMN可引起IR，如ISMN灌胃的W單組大鼠，其HOMA-IR與心肌組織NO水平呈正相關。也有研究證實，胰島素抵抗狀態與骨骼肌中誘導型NOS(iNOS)表達增多有關[14-15]。以上均提示，體內NO的增多會誘導IR的發生。另外，應用HFHG干預的W高組大鼠心肌組織中NO與其HOMA-IR呈顯著正相關，說明IR狀態下，大鼠心肌組織內NO增多。這或許與IR繼發的高胰島素血癥有關，因為胰島素在糖代謝失調時，可反應性增加內源性NO的生成。以上發現均提示NO增多與IR之間存在關聯，二者互相誘導、互為因果。

總之，IR、NO均可導致并加重雄性SHR心肌細胞凋亡，且IR、NO之間互相誘導。值得注意的是，本次實驗對象全部采用雄性大鼠，其所得數據不能代表整體大鼠。另外有研究認為，患者長期應用ISMN后，血管內皮功能將受到損害[16]，但本實驗大鼠飼養時間較短(僅12周)，未能反映ISMN對心肌的長期作用。SHR心肌細胞凋亡較普通大鼠增多。短期飼喂ISMN可加重SHR心肌細胞凋亡，且IR亦加重其凋亡。IR與心肌組織中NO互相誘導，原因未明。

參考文獻

[1]Stern MP.Diabetes and cardiovascular disease:the "common soil" hypothesis[J].Diabetes,1995,44(4):369-374.

[2]Chen HI,Hu CT.Endogenous nitric oxide on arterial hemodynamics:a comparison between normotensive and hypertensive rats[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,1997,273(4):H1816-1823.

[3]Wu CC,Yen MH.Higher level of plasma nitric oxide in spontaneously hypertensive rats[J].American J Hypertension,1999,12(5):476-482.

[4]Nava E,Noll G,Lüscher TF.Increased activity of constitutive nitric oxide synthase in cardiac endothelium in spontaneous hypertension[J].Circulation,1995,91(9):2310-2313.

[5]Wu CC,Hong HJ,Chou TC,et al.Evidence for inducible nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rats[J].Biochem Biophys Res Commun,1996,228(2):459-466.

[6]Wu CC,Yen MH.Nitric oxide synthase in spontaneously hypertensive rats[J].J Biomedical Science,1997,4(5):249-255.

[7] Yiu KH,Pong V,Siu CW,et al.Long-term oral nitrate therapy is associated with adverse outcome in diabetic patients following elective percutaneous coronary intervention[J].Cardiovasc Diabetol,2011,10(23):52.

[8]Hua W,Chen Q,Gong F,et al.Cardioprotection of H 2 S by downregulating iNOS and upregulating HO-1 expression in mice with CVB3-induced myocarditis[J].Life Scis,2013,93(24):949-954.

[9]Li YC,Luo Q,Ge LS,et al.Ivabradine inhibits the production of proinflammatory cytokines and inducible nitric oxide synthase in acute coxsackievirus B3-induced myocarditis[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,431(3):450-455.

[10]Dobrin JS,Lebeche D.Diabetic cardiomyopathy:signaling defects and therapeutic approaches[J].Expert Rev Cardiovasc Ther,2010,8(3):373-391.

[11]Boudina S,Abel ED.Diabetic cardiomyopathy,causes and effects[J].Rev Endocr Metabol Dis,2010,11(1):31-39.

[12]Khavandi K,Khavandi A,Asghar O,et al.Diabetic cardiomyopathy-a distinct disease?[J].Best Pract Research Clin Endocrinol Metabol,2009,23(3):347-360.

[13]Singh S,Duggal J,Khosla N,et al.Screening guidelines for coronary heart disease in diabetes:current recommendations[J].J Cardiometab Syndr,2009,4(2):107-112.

[14] Carvalho-Filho MaA,Ueno M,Carvalheira JB,et al.Targeted disruption of iNOS prevents LPS-induced S-nitrosation of IR/IRS-1 and AKT and insulin resistance in muscle of mice[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2006,291(3):E476-482.

[15]Carvalho-Filho MA,Ueno M,Hirabara SM,et al.S-Nitrosation of the insulin receptor,insulin receptor substrate 1,and protein kinase B/AKT a novel mechanism of insulin resistance[J].Diabetes,2005,54(4):959-967.

[16]Lai J,Wu B,Sun J,et al.Long-term isosorbide mononitrate treatment impairs endothelial function in patients with coronary artery disease[J].Coron Artery Dis,2013,24(7):566-571.

Influenc of insulin resistance and isosorbide mononitrate on myocardial cellular apoptosis in spontaneously hypertensive rats

BaiBing1,GeLongfei2,TianChenguang1△

(1.DepartmentofEndocrinology,SecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450000,China;2.DepartmentofEndocrinology,ZhengzhouMunicipalFirstPeople′sHospital,Zhengzhou,Henan450000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the influence of insulin resistance(IR) and isosorbide mononitrate(ISMN) on myocardial cellular apoptosis in spontaneously hypertensive rats(SHR).MethodsForty male 14-week old Wistar(W) rats and SHR(S) each were respectively or jointly fed with normal diet (ND),high fat and high glucose(HFHG) diet,normal saline(NS)and ISMN by gavage.Then they were randomly divided into the normal and NS group(normal W and normal S),HFHG and NS group(HFHG W and HFHG S),normal and ISMN group(ISMN W and ISMN S),HFHG and ISMN group(HI W and HI S),with 10 rats in each group.After 12-week feeding,carotid arterial blood was collected for detecting blood glucose concentration and insulin level and calculating insulin resistance index (HOMA-IR);4 myocardial tissue samples were taken for respectively observing the morphology under microscope,and detecting the NO level,myocardial Bcl-2,Bax gene and their protein expression levels in myocardial tissue.ResultsMyocardial NO level,Bax gene mRNA and related protein levels in the HFHG and ISMN intervention groups were higher than those in the normal group,while the bcl-2 gene mRNA and related protein expression were on the contrary;myocardial tissue NO level,Bax gene mRNA and related protein expression in the S groups were increased compared with the corresponding W groups,while the bcl-2 gene mRNA and related protein expression were on the contrary;in the HFHG W group,the myocardial tissue NO level had significantly positive correlation with HOMA-IR,and in the ISMN W group,HOMA-IR was positively correlated with the NO level in the myocardial tissue.ConclusionMyocardial cellular apoptosis of SHR is increased compared with Wistar rats;both IR and ISMN can aggravate the apoptosis of SHR myocardial cells,moreover IR has a mutual induction and reciprocal causation with ISMN.

[Key words]rats,suburbs SHR；insulin resistance;isosorbide mononitrate;apoptosis

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.009

作者簡介：白冰(1990-)，碩士研究生，主要從事糖尿病及其并發癥的診治研究。△通訊作者，E-mail：tcg90123@163.com。

[中圖分類號]R587.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2478-04

(收稿日期：2015-11-15修回日期：2016-03-10)