HPLC法測定大鼠血漿和腦組織中的埃克替尼濃度

楊梅

(中國醫學科學院 北京協和醫學院腫瘤醫院 藥劑科，北京 100021)

HPLC法測定大鼠血漿和腦組織中的埃克替尼濃度

楊梅Δ

(中國醫學科學院 北京協和醫學院腫瘤醫院 藥劑科，北京 100021)

目的 建立大鼠血漿和腦組織中埃克替尼濃度的HPLC測定方法。方法 將55只大鼠隨機分為11組，每個采樣時間點的動物數為5。給藥前12 h禁食，口服灌胃給予埃克替尼70 mg/kg。于給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24和48 h，分別采集大鼠靜脈血及腦組織，樣品經蛋白沉淀法處理后，采用Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；在流動相為水-乙腈(25:75)，流速為0.12 mL/min，334 nm波長處，保持柱溫25 ℃的條件下進樣20 μL檢測。結果 內源性雜質不干擾測定，埃克替尼在0.05～25 μg/mL范圍內具有良好的線性關系Y=0.793X+0.101，r=0.9986(血漿)和Y=0.84X+0.0818，r=0.9965(組織)，最低檢測限為0.05 μg/mL。低、中、高3個濃度的方法回收率和提取回收率分別為98.1%、102.1%、101.5%和64.3%、69.5%、75.8%，RSD%(n=5)分別為7.3、9.2、6.6和3.5、2.3、2.1。日內、日間精密度(RSD%，n=5)分別為7.14、5.82、3.79和8.08、6.24、4.43，均小于10%。給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12和24 h、48 h大鼠血漿和腦組織中埃克替尼濃度分別為0、(0.25±0.04)、(2.77±0.23)、(2.54±0.61)、(2.89±0.72)、(3.94±0.77)、(6.45±1.60)、(0.33±0.09)、(0.56±0.11)、(0.45±0.03)、(0.43±0.03)μg/mL和0、(0.20±0.07)、(0.14±0.06)、(0.11±0.01)、(0.15±0.08)、(0.11±0.03)、(0.13±0.04)、(0.07±0.01)、(0.08±0.02)、(0.06±0.02)、(0.05±0.01)μg/mL。結論 本方法簡便、快速、靈敏、準確、專屬性強、重現性好。

埃克替尼；HPLC；血漿；腦組織

埃克替尼是我國自主研制成功，第一個擁有自主知識產權的表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑，于2011年6月經SFDA批準上市，用于晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的治療[1-2]。對該藥物的研究也正隨著其廣泛應用而不斷深入[3-6]。研究藥物在體內的代謝情況，可以更好的為臨床用藥服務。目前對于埃克替尼能否透過血腦屏障進入腦組織的研究較少，本研究旨在建立一種簡便、快速、靈敏、準確、專屬性強、重現性好的HPLC方法，可用于大鼠體內埃克替尼的藥動學分析，并為臨床研究奠定基礎。

圖1 埃克替尼結構式Fig.1 The structure of icotinib

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物： 55只SD大鼠，SPF級，雄性，體質量(200±20)g；北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥品與試劑：鹽酸埃克替尼對照品(純度98%，浙江貝達藥業有限公司，批號20130902)；內標舒尼替尼(純度>99%，輝瑞制藥有限公司，批號U684A)。乙腈、甲醇為Fisher公司產品(色譜級)；Millipore去離子水；其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器：Waters高效液相色譜系統，包括：515泵，717自動進樣器，柱溫箱，溫度控制器，2487紫外檢測器，Epower色譜工作站；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；Allegra 21R低溫離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動相：水：乙腈(25:75)；流速：0.12 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：334 nm；柱溫：25 ℃。在上述色譜條件下，進樣埃克替尼及內標。

1.2.2 埃克替尼與內標儲備液的配制：精密稱取埃克替尼對照品30.0 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為600.0 μg/mL埃克替尼儲備液，于冰箱4 ℃保存；精密稱取舒尼替尼12.5 mg于50 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為250.0 μg/mL內標儲備液，于冰箱4 ℃保存。臨用時稀釋成25 μg/mL的內標溶液。

1.2.3 血漿樣品和組織：取血漿樣品或勻漿后的組織樣品100 μL，加25 μg/mL的內標溶液150 μL，混勻，加甲醇-乙腈(1:9)3mL，渦旋1 min后放置5 min，于3500 r/min離心10 min，取上清液于60 ℃水浴放置，氮氣吹干，殘渣用1.5 mL流動相溶解，離心(r=10cm，15000 rpm，10 min)，取上清液，進樣20 μL。

1.2.4 線性關系：分別配制0.05、0.1、0.5、2.5、5、10、25 μg/mL的埃克替尼對照品血漿或組織樣品，進樣20 μL檢測，以埃克替尼和內標物的峰面積比值為縱坐標，埃克替尼的濃度為橫坐標，進行線性回歸。

1.2.5 回收率、準確度和精密度的考察：分別配制埃克替尼濃度為低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，按樣品處理方法操作后測定，計算方法回收率。另用流動相配制相應系列的埃克替尼溶液，不經提取直接測定，以此為標準，將2組峰面積相比，計算埃克替尼的提取回收率。同法配制埃克替尼濃度為低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各5份，同日處理進行測定，計算日內相對標準差。以后取低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的樣品各1份，連續測定5d。

作為戰略性新興產業，傳統商貿企業應用電子商務對區域經濟發展至關重要。近年來，全市雖然安排了一定的財政資金用于扶持電子商務產業發展，但與杭州、深圳等發達地區設立專項資金支持傳統商貿企業應用電子商務相比，全市對電商的扶持力度還不夠大，政府對傳統商貿企業線上線下發展的引導作用沒有充分發揮。

1.2.6 穩定性考察

① 儲備液的穩定性考察 取埃克替尼和內標儲備液，分別在1、10、25、45、60 d用流動相配制成60和25 μg/mL的溶液直接進樣20 μL，記錄峰面積。

② 埃克替尼加內標血漿的穩定性考察 按“1.2.3”項下方法分別配制低、中、高3種濃度(0.5、5、25 μg/mL)的血漿樣品各5份，分別在短期(0、6、12、18、24 h)，長期(-20 ℃凍存1、5、10、20、30d)和凍融(1、2、3、4、5次)條件下進行色譜測定，記錄埃克替尼和內標的峰面積。

1.3 大鼠體內藥物濃度測定

1.3.1 分組及給藥方法：分組：按照采樣時間點即給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將55只大鼠隨機分為11組，每個采樣時間點的動物數為5。

給藥方法：精密稱取埃克替尼對照品200.0 mg于100 mL量瓶中，用去離子水(pH6.8)溶解并稀釋至刻度，得濃度為2 mg/mL埃克替尼溶液。大鼠在給藥前12 h禁食，按照70 mg/kg的劑量口服灌胃給予埃克替尼。

1.3.2 標本提取及處理：標本提取：于給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，將大鼠抓取固定后，使其頸部充分暴露，剪開頸部皮膚、肌肉，充分暴露血管，自頸靜脈取血5 mL；然后將大鼠斷頭，剪開顱骨，取腦組織1 g，標本放置于-20 ℃冰箱凍存待測。

標本處理：血液于3000 rpm/min離心10 min后取血漿。每份組織標本加入乙酸銨緩沖液2 mL，使用研缽充分研磨后，3000 r/min離心10 min后提取上清液，-20 ℃冰箱凍存。

2 結果

圖2 空白樣本、血漿和腦組織樣本及內標的HPLC圖譜1：埃克替尼；2：舒尼替尼Fig.2 HPLC chromatogram of negative samples, plasma and brain tissue samples, sunitinib1：icotinib; 2：sunitinib

2.2 線性關系 埃克替尼血漿樣品標準曲線的回歸方程為Y=0.793X+0.101，r=0.9986，組織樣品標準曲線的回歸方程Y=0.84X+0.0818，r=0.9965。顯示標準曲線在0.05～25 μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

2.3 回收率，準確度和精密度考察 按“1.2.5”項下方法計算方法回收率，提取回收率和日內、日間相對標準差。結果顯示，埃克替尼的方法回收率均>90%，日內、日間相對標準差均<10%。見表1。

表1 回收率和日內、日間精密度(n=5)

2.4 穩定性考察

2.4.1 儲備液的穩定性考察：埃克替尼和內標的峰面積的RSD均<5%，表明埃克替尼和內標儲備液至少在60 d內穩定。

2.4.2 埃克替尼加內標血漿的穩定性考察：埃克替尼和內標的穩定性結果見表2。短期、長期及凍融條件下2者峰面積的RSD均<10%。

表2 埃克替尼和內標的穩定性(n=5)

2.5 大鼠血漿和腦組織中的藥物濃度測定結果 大鼠灌胃給藥后，測定給藥前和給藥后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h血漿及腦組織中的藥物濃度，結果見表3。

表3 埃克替尼在大鼠血漿和腦組織中的藥物濃度±s，n=5)

3 討論

埃克替尼上市后，隨著研究的不斷深入，其在血漿和多種組織中的藥動學研究已有報道[7-8]。但藥物能否透過血腦屏障分布至腦組織，目前尚未見報道。因此本研究建立的埃克替尼在腦組織中的HPLC測定方法，為進一步研究藥物在腦組織中的藥動學特征及進行臨床研究奠定基礎。

藥物即使可透過血腦屏障進入腦組織，其含量也會相對較低，只有借助高靈敏度和高分辨力的測定方法才能滿足臨床和科研實驗的檢測要求。因此在探索該檢測方法時，基于既往研究的基礎上[9-10]，本研究建立的測定方法，藥物濃度在0.05～25 μg/mL之間具有良好的線性關系。回收率，批內、批間差異及穩定性均符合檢測要求。因此該方法靈敏、準確且簡便。

通過實驗發現，若柱平衡時間較短，連續進樣時對保留時間有所影響，因此柱平衡很重要。測定藥物在腦組織的含量時，為了將更多的藥物游離出來，蛋白質的去除是很關鍵的。本研究采用甲醇-乙腈沉淀蛋白法，簡單快捷，沉淀完全，色譜峰峰形良好，且獲得了較高的回收率，準確度和精密度考察結果。流動相的選擇參考相關文獻[10-11]，采用醋酸銨與乙腈或甲醇的不同配比進行分離，但均未達到完全分離。經反復實驗，采用本文所選的流動相配比分離效果最佳，樣品與內標在10 min內便可完全分離，且不受內源性雜峰的干擾。

本實驗建立了埃克替尼在血漿和腦組織中的HPLC檢測方法，本方法簡便、快速、靈敏、準確、專屬性強、重現性好。

通過本實驗建立的方法測定了藥物在大鼠血漿和腦組織中的濃度，表明藥物可部分透過血腦屏障進入腦組織，為藥物的臨床合理應用提供了實驗依據。

[1] 馬麗，韓曉紅，王帥，等. 鹽酸埃克替尼對肺癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中華醫學雜志，2012，92(36)：2561-2564.

[2]Sun Y, Shi Y, Zhang L, et al. A randomized,double-blind phase Ⅲ study of icotinib versus gefitinib in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) previously treated with chemotherapy (ICOGEN) [J].J Clin Oncol, 2011, 29(15): suppl 7522.

[3]譚芬來，王印祥，丁列明，等. 國家一類新藥鹽酸埃克替尼片大規模人群用藥的療效與安全性評價[J].中國藥物評價，20l2，29(l)：30-34.

[4]石遠凱. 鹽酸埃克替尼(凱美納)中國臨床使用經驗專家共識[J].中國新藥雜志，2012，21(6)：578.

[5]Shi Y, Zhang L, Liu X, et al. Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer (ICOGEN): a randomised, double-blind phase 3 non-inferiority trial [J].Lancet Onco,2013,14(10):953-961.

[6]張貝貝，林寶釵，何春曉，等. 埃克替尼治療非小細胞肺癌腦轉移的回顧性研究[J].臨床腫瘤學雜志，2013，18(9)：786-789.

[7]Liu D, Jiang J, Zhang L, et al. Clinical pharmacokinetics of Icotinib, an anti-cancer drug: evaluation of dose proportionality, food effect, and tolerability in healthy subjects [J].Cancer Chemother Pharmacol,2014,73(4):721-727.

[8]張逸凡，關忠民，陳笑艷. 抗腫瘤新藥埃克替尼在動物體內的藥動學和組織分布研究[J].中國新藥雜志，2014，23(2)：235-240.

[9]Guan Z,Chen X,Wang Y,et al. Metabolite identification of a new antitumor agent icotinib in rats using liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J].Rapid Commun Mass Spectrom. 2008,22(14):2176-2184.

[10]Zhao Q,Shentu J,Xu N, et al. Phase I study of cotinib hydrochloride(BPI-2009H), an oralEGFRtyrosine kinase inhibitor,in patients with advanced NSCLC and other solid tumors [J].Lung Cancer, 2011, 73(2):195-202.

[11]Liu D, Jiang J,Zhang L, et al. Metabolite characterization of a novel anti-cancer agent ,icotinib,in humans through liquidchromatography/quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry [J].Rapid Commun Mass Spectrom,2011,25(15):2131-2140.

(編校：王冬梅)

Determination of icotinib in rat plasma and brain tissue by HPLC

YANG MeiΔ

(Department of Pharmacy, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Mdeical College, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of icotinib in rat plasma and brain tissue.MethodsFifty-five rats were randomly divided into 11 groups, each group was five rats. Administration of 12 h before fasting, oral intragastric administration of icotinib 70 mg/kg. The plasma and brain tissue samples were pretreated by protein precipitation,and the separation was performed on a Waters X Terra RP C18column (2.1 mm×150 mm，5 μm)before and after administration 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48 h.The mobile phase consisted of water-acetonitrile(25:75), at a flow rate of 0.12 mL/min.Detection was carried out at the wave length of 334 nm and the column temperature of 25 ℃.The sample size was 20 μL.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.05-25 μg/mL, the lowest limit of detection was 0.05 μg/mL,Y=0.793X+0.101 andr=0.9986(plasma),Y=0.84X+0.0818 andr=0.9965(tissue). The method recoveries and extraction recoveries of three concentrations were respectively 98.1%, 102.1%, 101.5% and 64.3%, 69.5%, 75.8%; RSD%(n=5)were respectively 7.3, 9.2, 6.6 and 3.5, 2.3, 2.1. The intra- and inter- day precisions(RSD%,n=5) were respectively 7.14, 5.82, 3.79 and 8.08, 6.24, 4.43, less than 10%. Administration of before and after 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 h, icotinib concentrations of plasma and brain tissue in rats were respectively 0, 0.25±0.04, 2.77±0.23, 2.54±0.61, 2.89±0.72, 3.94±0.77, 6.45±1.60, 0.33±0.09, 0.56±0.11, 0.45±0.03, 0.43±0.03 μg/mL and 0, 0.20±0.07, 0.14±0.06, 0.11±0.01, 0.15±0.08, 0.11±0.03, 0.13±0.04, 0.07±0.01, 0.08±0.02, 0.06±0.02, 0.05±0.01 μg/mL.ConclusionThe HPLC method is simple, rapid, sensitive, accurate, highly specific and reproductive.

icotinib; HPLC; plasma; brain tissue

中國醫學科學院腫瘤醫院臨床課題(LC2011B39)

楊梅，通信作者，女，碩士，主管藥師，研究方向：醫院藥學，臨床藥學，E-mail：yangmei910@163.com。

R927.2;O657.72

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.55