血清miR-21-5P和miR-155-5P表達對百草枯中毒患者診斷及預后的影響

蘭超　郭楠楠　裴輝　史曉朋　張華麗　喬英杰

(鄭州大學第一附屬醫院 急診醫學部　河南 鄭州　450052)

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血清miR-21-5P和miR-155-5P表達對百草枯中毒患者診斷及預后的影響

蘭超郭楠楠裴輝史曉朋張華麗喬英杰

(鄭州大學第一附屬醫院 急診醫學部河南 鄭州450052)

【摘要】目的探討血清miR-21-5P和miR-155-5P的表達對百草枯中毒患者診斷和預后的影響。方法選擇2014年11月至2015年8月鄭州大學第一附屬醫院收治的102例百草枯中毒患者，按入院時尿百草枯濃度分為輕型(32例)、中型(42例)、重型(28例)3組，并選取健康人30例作為對照組。記錄各組患者臨床資料，統計相關實驗室檢查指標，并通過RT-PCR檢測受試者血清miR-21-5P和miR-155-5P的表達量，評估miR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒臨床診療中的價值。結果血清miR-21-5P和miR-155-5P診斷百草枯中毒的ROC曲線下面積分別是88.3%和83.9%；重型組的兩種標志物表達量明顯高于中型組、輕型組和健康組，差異有統計學意義(P<0.05)；死亡組miR-21-5P和miR-155-5P表達量均高于存活組，差異亦有統計學意義(P<0.05)。結論百草枯中毒患者外周血 miR-21-5P和miR-155-5P表達水平增高，可能成為百草枯中毒診斷的標志物。兩者對區分百草枯中毒嚴重程度及判斷預后都具有積極的臨床意義。

【關鍵詞】百草枯中毒；miRNA；診斷；預后

百草枯為有機雜環類接觸性除草劑，可經皮膚、呼吸道及消化道吸收造成急性中毒，是內科常見除草劑急性中毒之一。目前臨床上尚缺乏特效治療方法，有報道顯示其病死率高達50%～80%[1]。百草枯可損害多個臟器功能，其中肺損傷是最突出和最嚴重的改變，可導致“百草枯肺”，早期表現為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，后期則出現肺泡內和肺間質纖維化，是百草枯中毒患者致死的主要原因。

微小RNAs(MicroRNAs)又簡稱miRNAs，是一類長約19～25個核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于動物、植物、病毒和單個細胞等生物體中。miRNAs是一類重要的轉錄后調節基因，具有調節細胞增殖、分化、凋亡等過程的功能，并且可在血清中穩定表達[2]。近年來，miR-21-5P和miR-155-5P在免疫調節、肺損傷和肺纖維化等病理生理的發生、發展過程中的調控機制研究得到了廣泛的關注[3]，然而對于miR-21-5P和miR-155-5P在百草枯中毒的診斷及預后判斷方面尚缺乏臨床病例研究。本研究采用實時熒光定量反應(RT-PCR)檢測百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P的相對表達量，對照臨床相關指標，探討miR-21-5P和miR-155-5P對百草枯中毒診斷及預后的指導意義。

1資料和方法

1.1主要儀器和試劑miRNA提取分離試劑盒：TIANGEN DP501(北京天根生化科技有限公司)；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒：TIANGEN KR201(北京天根生化科技有限公司)；miRNA熒光定量檢測試劑盒：TIANGEN FP401(北京天根生化科技有限公司)；ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Bioplastics PCR八連管(上海百研生物科技有限公司)。

1.2研究對象選擇2014年11月至2015年8月鄭州大學第一附屬醫院收治的102例百草枯中毒患者進行研究。所有患者入院后均做尿液快速半定量檢測，并按尿百草枯濃度檢測結果分為3組：輕型(尿百草枯濃度<10 μg/ml)32例，中型(尿百草枯濃度10～30 μg/ml)42例，重型(尿百草枯濃度>30 μg/ml)28例。各組按轉歸分為死亡和存活兩個亞組。選取30例健康體檢者作為對照組。納入標準：口服中毒，中毒距入院時間在4～24 h 內(多數患者來院不是首診，故入院距服毒時間較長)，入院前未接受過血液灌流或血液凈化治療，既往無肺、肝、腎、心臟、腫瘤及血液系統等疾病，資料完整。診斷及分型標準：參照全國統編教材《急診醫學》《預防醫學》“百草枯中毒”相關章節及國家標準《職業性急性百草枯中毒的診斷》和2013年第三屆全國百草枯農藥中毒學術會議對百草枯中毒診斷與治療的“泰山共識”進行百草枯中毒診斷和分型。排除標準：合并其他毒物中毒者，妊娠及既往有肺、心臟、肝、腎、腫瘤及血液系統等疾病者。本項研究符合醫學倫理學標準，所有研究對象均簽署知情同意書，本項研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.3治療方法對服毒距入院時間<8 h的患者均給予清水洗胃，所有患者均給予活性碳或蒙脫石散吸附并給予導瀉，置尿管導尿，在棄去膀胱內的殘余尿后1 h留取尿標本待檢。同時應用大劑量糖皮質激素(甲潑尼龍500～1 000 mg/d)、環磷酰胺、烏司他丁、血必凈注射液及保護器官藥物，口服心得安等藥物以對抗百草枯毒性。當患者出現嚴重呼吸困難及動脈血氧分壓(PaO2) <40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)時給予低流量鼻導管吸氧。在取得患者和家屬同意后給予床旁血液灌流(灌流均在留取血、尿標本之后進行)。

1.4檢測指標及方法檢測指標：記錄患者的姓名、性別、年齡、中毒劑量、中毒距就診時間、中毒距洗胃時間及28 d預后，同時記錄患者入院時的尿百草枯濃度、白細胞計數(WBC)、尿素氮(BUN)、谷丙轉氨酶(ALT)、D二聚體(D-D)、動脈血乳酸(Lac)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)和急性生理和慢性健康狀態評分(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ評分)等指標。健康對照組同期進行。

血清miR-21-5P和miR-155-5P的測定：于患者入院12 h內、血液灌流前抽取靜脈血5 ml，在4 ℃下3 000 r/min離心10 min，提取血清；提取血清中總的miRNA；對miRNA 3’末端進行加Poly (A)處理，再進行逆轉錄反應生成miRNA對應的cDNA第一鏈；采用SYBR GreenI 染料法進行熒光定量檢測miR-21-5P和miR-155-5P相對表達量(以上步驟均按照試劑說明書步驟進行，引物序列及內參照U6均由北京天根生化科技有限公司合成)。本實驗采用ABI7500Fast實時熒光定量PCR儀進行檢測分析，以U6為內參照基因。采用2-△△Ct法計算miRNA的相對表達量(△△Ct=CtmiRNA-CtU6)。

1.5統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。符合正態分布的兩組定量資料比較采用t檢驗(方差不齊時采用校正t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，構成比的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。繪制miR-21-5P、miR-155-5P診斷百草枯中毒的ROC 曲線，并計算曲線下面積。

2結果

2.1一般資料共納入102例百草枯中毒患者，其中男48例，女54例，年齡14～65歲，中毒劑量5～300 ml，中毒至就診時間0.4～22 h，中毒距洗胃時間為0.4～8 h。中毒后28 d 內存活44例，死亡58例，病死率56.9%。按入院時尿百草枯濃度分為輕型、中型、重型3組。3組間性別、年齡、中毒距就診時間差異均無統計學意義(P>0.05)；3組間中毒劑量、中毒距洗胃時間、WBC、BUN、ALT、PaCO2、Lac、APACHE Ⅱ評分差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　百草枯中毒患者入組時一般資料比較

2.2血清中miR-21-5P和miR-155-5P的表達對百草枯中毒的診斷效能miR-21-5P診斷百草枯中毒的曲線下面積是88.3%(95%CI：0.813～0.953)，當miR-21-5P表達量為0.56時約登指數為最大值。miR-155-5P診斷百草枯中毒的曲線下面積是83.9%(95%CI：0.759～0.919)，當miR-155-5P表達量為0.67時約登指數為最大值。見圖1。

圖1　miR-21和miR-155診斷百草枯中毒的ROC曲線

2.3不同嚴重程度百草枯中毒患者血清中miR-21-5P和miR-155-5P表達量對比重型組的miR-21-5P和miR-155-5P表達量明顯高于中型組、輕型組和健康組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　不同嚴重程度百草枯中毒患者血清miR-21-5P和

2.4百草枯中毒患者預后相關因素分析將102例百草枯中毒患者按中毒后28 d預后分為存活組和死亡組，兩組間性別、年齡、中毒距就診時間差異均無統計學意義(P>0.05)；死亡組中毒劑量、中毒距洗胃時間、尿百草枯濃度、WBC、BUN、ALT、Lac、APACHE Ⅱ評分、miR-21-5P和miR-155-5P表達量明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)，PaCO2明顯低于存活組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3　存活組和死亡組各項臨床指標比較

3討論

百草枯中毒多以消化道吸收中毒常見，患者多為自服或誤服中毒。百草枯口服后吸收迅速，0.5～4 h達血漿濃度峰值，吸收后迅速分布到肺、腎、肝等器官，并在肺內聚集[4]。急性百草枯中毒機制較復雜，除了百草枯本身理化作用外，還有大量的炎性因子和細胞因子參與機體的氧化損傷、炎癥反應、凝血系統異常、細胞凋亡等過程[5]。臨床上可出現多臟器功能受損，其中以肺損傷為主，危害最大。近年來百草枯中毒的發病率愈來愈高，國內外一直致力于百草枯中毒的研究，但至今尚無有效解毒藥，許多治療方法仍處于探索中，缺乏循證醫學的證據。

miRNAs是一類非常重要的機體調控因子，在調節生長、維持生物體自身穩態、參與疾病病理生理過程等方面都發揮重要作用，是近年來的研究熱點。已有諸多研究表明，miRNAs與肺損傷、肺內纖維化的發生發展密切相關。有研究發現，內毒素可引起巨噬細胞中miR-132、miR-146a、miR-155表達水平增加。還有研究發現，特發性肺纖維化進展速度快慢可能是miR-302c、miR-423-5p、miR-210等調節的結果。另有研究表明，let-7對肺纖維化的發生發展起著負調控作用，提出let-7d不僅可能是肺纖維化一個潛在的治療靶點，還可能是監測疾病進展的一個標志物。

miR-21-5P編碼基因定位于TMEM49基因編碼區內，通過自身啟動區完成轉錄及poly A尾聚合，最終變為成熟的miRNA。miR-21與多種疾病相關[5]。有的研究發現，miR-21在博萊霉素誘導的纖維化小鼠和特發性肺纖維化患者肺內的表達都增高，提示miR-21對肺纖維化發生起著正向推動作用。此外，還有研究證明，miR-21參與調節機體免疫過程，對不同信號傳導的靶蛋白起關鍵調控作用。本項研究顯示miR-21-5P表達量上調，可做為百草枯中毒診斷的標志物，具體作用機制尚不明確，可能與百草枯中毒患者大多存在肺損傷和肺纖維化有關。

miR-155-5P是一個多功能miRNA，位于人類21號染色體B細胞非編碼集合基因簇的第3個外顯子中，在免疫應答的調控中發揮重要作用[7]。有研究表明miR-155能夠影響Th1、Th2細胞的功能，對活化T細胞具有一定調節作用[8]。汪勤等[9]的研究表明miR-155參與對Treg細胞增殖的調節，在膿毒癥免疫失衡機制中發揮一定的作用。本研究結果顯示，健康組與輕中重型組間、生存組與死亡組間miR-155-5P表達量差異有統計學意義(P<0.05)。由此推斷，miR-155-5P可作為百草枯中毒診斷的標志物，亦可對百草枯中毒診斷、病情嚴重程度、預后做出預警。

綜上所述，本實驗探討了miR-21-5P和miR-155-5P與百草枯中毒診斷及預后判斷的關系，結果發現健康組與輕中重型組間、生存組與死亡組間miR-21-5P和miR-155-5P表達量差異有統計學意義(P<0.05)，miR-21-5P、miR-155-5P在死亡組的相對表達量顯著增高。miR-21-5P和miR-155-5P可作為百草枯中毒診斷和預后判斷的新標志物，作為基因層面的生物標記物，有可能為百草枯中毒的治療開辟新的天地。本項研究的樣本量較小，且未進行遠期預后的隨訪，不能明確miR-21-5P和miR-155-5P對百草枯中毒遠期預后的影響。總之，這兩個標志物對百草枯中毒的臨床意義還需更加深入的研究。

參考文獻

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The guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication

Lan Chao, Guo Nannan, Pei Hui, Shi Xiaopeng, Zhang Huali, Qiao Yingjie

(DepartmentofEmergency,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the guiding significance of miR-21-5P and miR-155-5P expressed in serum for the diagnosis and prognosis of paraquat intoxication. Methods102 cases of patients with paraquat intoxication in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University from November of 2014 to August of 2015 were chosen and divided into the mild group(n=32), moderate group(n=42), and severe group(n=28) according to their semi-quantification results of urine paraqua when they were admitted to the hospital. At the same time, 30 healthy persons were selected as the control group. The clinical data and related indicators of each group were collected, and the expression of miR-21-5P and miR-155-5P was measured to evaluate their clinical value in the diagnosis and treatment of paraquat intoxication. ResultsThe area under the ROC curve was 0.883 for the diagnosis of paraquat intoxication using miR-21-5P, while that was 0.839 using miR-155-5P. The expression of miR-21-5P and miR-155-5P was statistically different between the healthy, mild, moderate, and severe groups. There was also statistically significant difference between survival and death group (P<0.05). ConclusionThe expression of miR-21-5P and miR-155-5P in serum may be used as an indicator for the diagnosis of paraquat intoxication, and they have positive clinical significance for the prognosis of paraquat intoxication.

【Key words】paraquat intoxication; miRNA; diagnosis; prognosis

基金項目：國家臨床重點專科項目(2012649)；河南省基礎與前沿

通訊作者：蘭超，E-mail：lanchao29@163.com。

【中圖分類號】R 605.97

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.06.003

(收稿日期：2016-03-11)

技術研究計劃項目(142300410068)。