核桃餅粕蛋白質及其開發利用

金子純，張潤光，韓軍岐，馬樂，楊曦，王旭琳，張有林

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

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核桃餅粕蛋白質及其開發利用

金子純，張潤光，韓軍岐，馬樂，楊曦，王旭琳，張有林*

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

摘要核桃餅粕中蛋白質含量很高，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等對人體有重要保健功能的氨基酸含量豐富。但核桃餅粕常被廢棄或作為飼料低價出售，造成資源極大浪費。因此高效提取核桃餅粕蛋白質并廣泛應用于工業生產中對核桃資源綜合利用具有重要意義。文中重點綜述了核桃餅粕蛋白質及其制備純化方法、功能特性，并討論了核桃餅粕蛋白質的開發利用。

關鍵詞核桃餅粕蛋白質；制備純化；功能特性；開發利用

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃，原產于亞洲西部[1]，是我國重要的經濟樹種之一。據世界糧農組織(FAO)統計，2014年我國核桃年產量達271萬t，超出世界年產量的50%，居世界首位，且預計在未來5～10年內，年產量最高可達500萬t[2]。核桃仁中蛋白質含量約為14%～18%[3]，可消化率達85%[4]，與其他植物蛋白資源相比，核桃仁蛋白質18種氨基酸齊全、8種必需氨基酸含量適中，同時精氨酸和谷氨酸含量也相對較高[5-7]，這些成分皆是人體組織細胞代謝不可缺少的重要物質，長期食用可對人體產生良好的保健效果，還可以間接降低冠心病患病風險[8-10]。目前提取食用油脂是核桃仁的主要加工途徑，去油后的核桃餅粕仍然保留著果仁的主要營養成分[11]，蛋白質含量豐富。但核桃餅粕經簡單加工后主要用作肥料或飼料，利用率很低[12]，高效提取核桃餅粕蛋白質已成為后續多元功能產品生產中的首要研究任務。目前，針對核桃餅粕蛋白質提取工藝的研究方面少有報道。本文對核桃餅粕蛋白質的制備純化方法、功能特性及其開發利用等方面的研究進展進行了綜合論述。

1核桃餅粕蛋白質

核桃餅粕是核桃仁提取油脂后的產品，由物理壓榨法得到的稱為“餅”；由浸出法得到的稱為“粕”。康俊杰等[12]以核桃餅粕為試材，測得其中蛋白質含量為47.4%。杜蕾蕾等[13]以冷榨核桃餅粕為試材，測定餅粕中蛋白質含量為53.89%。由此可知，核桃餅粕含有50%左右的蛋白質，與大豆餅粕蛋白質含量相當[14]。

以核桃餅粕為原料進行生產時，核桃仁種皮在很大程度上影響了產品的風味與營養價值。因為核桃種皮中單寧含量較高，不僅使得核桃仁略帶苦味，還會與蛋白質結合形成沉淀復合物從而降低產品品質，因此最好于榨油前將核桃仁種皮脫去。參照李秀鳳[15]的研究可采用NaOH和CaCl2混合堿液浸泡、高壓自來水沖洗的方法對核桃仁去皮，即可達到很好的去皮效果，且原料損耗少。此外，高質量原料餅粕的獲得還與脫油方式直接相關，壓榨法因操作簡單、易于控制、可最大程度保留油中天然營養成分、無有機溶劑殘留等優點被廣泛用于制油工藝。在不增加成本的前提下，可研究以油脂、蛋白質聯產為目標的新工藝。沈敏江[16]對傳統油脂冷榨工藝進行了優化，可較高程度地達到油脂、蛋白質聯產目的，得到的核桃餅粕中蛋白質含量高達55%，殘油量僅4%。溫凱等[17]研究了不同榨油器械對核桃餅粕質量的影響，結果表明，采用二級聯合冷榨技術效果最好，即先使用立筒式液壓榨油機壓榨，再使用低溫冷榨螺旋榨油機進行二次壓榨，既保證了核桃油的品質，也為生產高蛋白脫脂核桃粉提供了良好的原料。

按所提產品中蛋白質含量的不同可將核桃餅粕蛋白質的制品分為核桃粉、核桃餅粕濃縮蛋白和核桃餅粕分離蛋白3種。核桃粉蛋白質含量一般低于60%，濃縮蛋白要求質量分數至少高于70%，而分離蛋白則要求在90%以上。SZE-TAO等[6]利用蛋白質分級沉淀法，從核桃粉中分離得到6.8%的清蛋白、17.6%的球蛋白、5.5%的醇溶蛋白和70.1%的谷蛋白，沈敏江[16]利用相同的方法也得到了基本一致的結果，并通過SDS-PAGE分析得出，不同品種間的谷蛋白亞基數量基本一致，均由7個亞基組成，分子質量分別為39.81、37.21、35.09、22.17、20.63、18.60、17.23 kDa。而球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白以及聚集體蛋白的亞基數量也基本大同小異。其中，清蛋白和球蛋白的分子質量主要集中在為10 kDa附近，因為清蛋白和球蛋白一般以單體的形式存在。還有少量分子質量在40～70 kDa的條帶，則可能與蛋白質聚集體有關。此外，賴氨酸是核桃粉、核桃餅粕濃縮蛋白、分離蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白的第一限制氨基酸，而亮氨酸是醇溶蛋白的第一限制性氨基酸。毛曉英[18]利用凝膠色譜測定蛋白質的相對分子質量分布，得出核桃餅粕分離蛋白的分子質量分布相對單一，集中在89.6 kDa左右；濃縮蛋白較為復雜，集中在11～79 kDa。經過SDS-PAGE分析對比分離蛋白、濃縮蛋白以及核桃粉的亞基組成情況，發現它們的分子質量范圍在20～110 kDa，包含9個條帶，11條多肽鏈。通過掃描電鏡結果顯示，三者的微結構存在著明顯的差異：核桃餅粕分離蛋白顯示出較大且稀松的片層結構，濃縮蛋白顯示出較小且緊實的片層結構，而核桃粉除顯示出較小的片層結構之外，還夾雜了許多小的脂肪粒子。

2核桃餅粕蛋白質的制備純化方法

目前，核桃餅粕蛋白質的制備純化方法主要有稀酸沉淀法、堿溶酸沉法、酶解法、乙醇浸洗法等。其中，稀酸沉淀法操作簡便、蛋白質得率高；堿溶酸沉法產品純度高、質量好；而酶解法在環保和生產安全方面更勝一籌。

2.1稀酸沉淀法

稀酸沉淀法主要用來制備濃縮蛋白，核桃餅粕濃縮蛋白是指經過粉碎、浸提、分離、干燥等加工工藝，去除了核桃餅粕中殘留油脂、低分子可溶性非蛋白組分(主要是可溶性糖、灰分、醇溶蛋白和各種氣味物質等)后所制得的產品。目前市場上大豆濃縮蛋白制品已屢見不鮮，但是以谷蛋白為主要組分的核桃濃縮蛋白研究卻仍處在實驗室階段，因此關于核桃濃縮蛋白制備工藝的研究僅有少量報道。毛曉英等[19]參照大豆濃縮蛋白制備法，以核桃餅粕脫脂粉為原料采用酸沉法提取濃縮蛋白，經過醇洗、過濾、酸化使蛋白質析出，再通過攪拌、離心、沉淀、水洗至中性、冷凍干燥等步驟，得到含量達75%的核桃餅粕濃縮蛋白制品。MAO等[20-21]在25 ℃下將核桃脫脂粉與體積分數95%乙醇溶液攪拌后，過濾得濾渣，分散在去離子水中，經過酸化、攪拌、離心、去離子水清洗沉淀，再用NaOH調pH至中性，最后冷凍干燥得到了蛋白質含量高達75.56%的核桃餅粕濃縮蛋白。

2.2堿溶酸沉法

國內外制備核桃餅粕分離蛋白一般采用堿溶酸沉法，此法所得產品純度高，且溶解性較濃縮蛋白好，但得率一般低于濃縮蛋白制備法。采用堿溶酸沉法制備分離蛋白一般大致經過如下流程：核桃餅粕→堿溶→酸沉淀→水洗→中和→干燥→得分離蛋白。堿溶酸沉法的原理是利用稀堿溶液首先將蛋白質浸提出來，用離心分離除去餅粕中的不溶性物質，再用稀酸將pH值調至蛋白質等電點，使蛋白質析出、然后離心分離得到初級蛋白，再經過洗滌、中和、干燥等步驟，得到分離蛋白。毛曉英等[19]采用堿溶酸沉法先將核桃脫脂粉蛋白液pH值調至11，然后在提取濃縮蛋白的基礎上，進一步成功制備出了純度達90.5%以上的核桃分離蛋白，制品純度高、溶解性較好，但風味色澤較其它產品略差。CHEN等[22]以核桃脫脂粉為原料，溶于NaOH溶液，經過攪拌、酸化、離心、水洗至中性、冷凍干燥制得核桃分離蛋白。QIN等[23]以己烷脫脂、干燥后的核桃脫脂粉為原料，按照如下工藝制備核桃分離蛋白：核桃脫脂粉→去離子水浸泡→調節pH值為8.5→靜置→離心→酸化→離心→沉淀→去離子水水洗→透析3次。

堿溶酸沉法提取過程較復雜，且不易控制，提取效果受到pH值、料液比、提取溫度、提取時間等因素的影響。其中，pH值對提取效果的影響最為顯著。其次，堿溶時料液比對提取效果也有較大影響，一定范圍內蛋白質溶出率隨料液比的提高而增加。最后，提取溫度和時間對核桃餅粕分離蛋白提取效果也有一定影響。隨著溫度上升，蛋白質提取率變化趨勢呈現拋物線形。針對以上因素，有研究[19]通過響應面分析給出了最佳優化條件并進行驗證，結果表明，在pH 11、料液比1∶26(g∶mL)、提取溫度53 ℃、提取時間1.5 h的條件下，蛋白質提取率可達82%。

然而采用堿溶酸沉法所提蛋白制品色澤都較深，嚴重影響產品外觀。為改善核桃餅粕分離蛋白色澤，姜莉等[24]研究發現，在制備過程中添加Na2SO3溶液，可有效提高所得蛋白制品白潔度(鹽析)。杜蕾蕾等[13]分別研究了活性炭、高嶺土、抗壞血酸、過氧化氫對山核桃分離蛋白脫色效果的影響，結果表明，抗壞血酸和過氧化氫對山核桃分離蛋白的脫色效果不明顯，活性炭和高嶺土均有較顯著的脫色效果，但隨著添加劑量增高，蛋白質的損失也逐漸加大。綜合考慮脫色效果與減少蛋白損失，3%的高嶺土可達到最佳效果。此外，范方宇等[25]研究發現堿溶蛋白時pH值對所提蛋白制品顏色有較大影響，pH 9.0時，蛋白制品呈紫褐色；pH 7.0～8.0時，蛋白顏色較淺，最終確定核桃蛋白提取最佳pH 7.5。

2.3酶解法

利用某些蛋白酶，如胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等對核桃餅粕蛋白質進行酶解處理，進而利用得到的產物繼續進行活性分析或者食品生產，目前為止，這已經成為當下核桃餅粕蛋白質一大科研熱點。CHEN等[22]在中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶中篩選出合適的酶和酶解條件對核桃餅粕分離蛋白進行處理，得到具有抗氧化活性的多肽。康俊杰等[12]使用中性蛋白酶和植物蛋白酶按照一定比例復配對核桃餅粕直接進行酶解，最終獲得抗氧化酶解液，多肽得率高達85.87%。張全才等[26]用復合蛋白酶和風味蛋白酶對核桃餅粕進行酶解、濃縮，最終制得60.3%的核桃餅粕蛋白質，開發出以酥油香味與核桃香味并存的速溶核桃風味酥油茶。

2.4其他方法

除了以上方法之外，研究核桃餅粕蛋白還可使用乙醇浸洗法、膜分離法、離子交換法、等電沉淀法等新型方法。乙醇浸洗法即使用一定濃度的乙醇溶液浸洗核桃脫脂餅粕，使其變性，失去可溶性，再通過脫溶、干燥除去其中的醇溶性成分和水溶性糖類物質，從而提高蛋白質的含量。此方法可用于制備核桃餅粕濃縮蛋白，但是缺點在于此法會降低蛋白質的溶解性，不利于后續加工。膜分離法是指采用RO(反滲透)膜分離低分子蛋白的方法，具有耗能低、操作簡單、無相變、分離效果好等優點，提取蛋白質消化率較高，商業價值顯著。離子交換法原理基本與堿溶酸沉法相同，但離子交換法是通過離子交換調節溶液pH值，從而使蛋白質溶出、沉淀，但此法生產周期較其他幾種方法長。目前這2種方法均存在一定缺陷，有待進一步研究。

3核桃餅粕蛋白質的功能特性及其影響因素

3.1溶解性

蛋白質的溶解度即在一定條件下離心后，上清液中蛋白質含量與樣品中總蛋白含量之比，它是評價蛋白質質量的重要參數，還會影響蛋白質的其他功能特性。由于核桃種皮中酚類和單寧類物質的存在，核桃仁蛋白質本身的溶解性較差，因此，去皮后制成核桃蛋白粉、核桃餅粕濃縮蛋白和分離蛋白，其溶解性有很大提高[18，27]，促進了核桃餅粕在飲料生產中的應用。此外，核桃餅粕蛋白質的溶解性還受到諸如pH值、電解質等的影響。在一定范圍內，溶解度與pH的關系呈U形曲線關系，在pH 5.0左右時，即核桃餅粕蛋白質的等電點處溶解性最差。在鹽濃度為0.1～1 mol/L時，核桃餅粕蛋白的溶解性隨著鹽濃度增加而提高，相對于核桃餅粕濃縮蛋白和分離蛋白，核桃蛋白粉的增長趨勢較平緩[20]。

3.2乳化性及乳化穩定性

核桃餅粕蛋白質具有較強的乳化穩定性，它的乳化性與溶解性呈現一定的正相關性，良好的乳化能力有助于其在乳狀液類型產品方面的開發。核桃蛋白粉、核桃餅粕濃縮蛋白和分離蛋白的乳化性及乳化穩定性同時受到pH和鹽濃度的影響[20-21]。蛋白質處于等電點附近時，其溶解性、乳化性及乳化穩定性最低，而在酸、堿性條件下均有明顯提高。在NaCl濃度位于0～0.4 mol/L時，蛋白質乳化性及乳化穩定性隨著濃度增大而升高；而濃度在0.4～1 mol/L時，兩者隨著濃度增大而降低。這是因為鹽離子通過靜電屏蔽減小了靜電斥力，而高濃度電解質改變水分子的組織結構，同時也改變了非極性基團間疏水作用力的強度。此外，核桃餅粕蛋白質的乳化性及乳化穩定性還到受蛋白質濃度和外界溫度的影響[28]。

3.3起泡性及泡沫穩定性

蛋白質的起泡性是指將其振蕩和攪拌后起泡的能力，泡沫穩定性是產生的泡沫穩定存在的能力，兩者在泡沫型產品的后續加工中有著重要的作用，它們受到pH值、鹽濃度、蔗糖等因素的影響[21，29]。在等電點附近，核桃餅粕蛋白質的起泡性及泡沫穩定性達到最小值，當pH值增大或減小時，兩者均有不同幅度的增加。在NaCl濃度達到0.6 mol/L時，核桃餅粕蛋白質的起泡性及泡沫穩定性達到最大值；而增大或減小NaCl濃度時，兩者均有所下降。蔗糖是蛋白質后續加工中常見的輔料，其濃度越大，蛋白質的起泡性及泡沫穩定性越小。

3.4吸油性和吸水性

蛋白質的吸油性體現了蛋白質與脂肪的結合能力，有利于其在肉制品加工中的應用。吸油性良好的蛋白質作為肉制品添加劑或填充劑，可有助于風味保留，改善口感[30]。根據MAO等[20]的研究，核桃餅粕分離蛋白和濃縮蛋白均具有良好的吸油性，隨著溫度的升高，吸油性的變化趨勢先降低再升高。

在肉制品和烘焙食品加工中，蛋白質良好的吸水性有利于改善產品質量。核桃蛋白粉的吸水性強于核桃餅粕分離蛋白和濃縮蛋白，在一定范圍內，核桃餅粕蛋白質的吸水性隨著pH值的增大先減小再增加，隨著NaCl濃度增大先增加再減小[21]。

3.5黏度

蛋白質的黏度是指蛋白質溶液在流動時，分子間產生內摩擦的性質，大小用黏度來表示，是一個在調整食品特性方面的重要參考指標，不僅可以穩定食品成分，還可以改善口感。核桃餅粕蛋白質的黏度主要受溫度的影響，隨溫度的升高先升高后降低，這是由于溫度升高帶動分子熱運動劇烈從而引起黏滯[29]。

4核桃餅粕蛋白質的開發利用

4.1在醫藥方面的應用

近年來，核桃餅粕蛋白質因其產品具有抗氧化、抗心血管疾病、抗肥胖、抗糖尿病等多種生理功能[31-33]，作為生產核桃多肽的原料，被廣泛應用于醫藥研究方面。經研究發現，蛋白質經消化道酶促水解成活性肽，從而可以更快速地被吸收利用，由于它具有多種藥用功能，可用于篩選藥物，制備疫苗[34]。目前市面上有關生物活性肽的產品已屢見不鮮，但制備大多以豆類為原料，核桃餅粕作為高蛋白源，卻極少應用于實際生產。GU等[35]以蛋白質含量為46.14%的核桃脫脂粉為原料，通過胰蛋白酶酶解，發現水解產物具有高抗氧化功能，可以清除小鼠腫瘤細胞中的活性氧。WANG等[36]采用超濾作用結合柱層析法以及高效液相色譜法，從核桃蛋白水解產物中制得一種具有抗血管緊張素轉化酶作用的新型肽——P-1al，可用于降低血壓。WU等[7]采用黑曲霉固態發酵法從核桃粕中制備天然抗氧化肽，通過多項抗氧化指標得出一種安全性高、條件溫和并且適用于大規模生產核桃多肽的制備方法。宗玉霞[37]通過陰陽離子混合床脫鹽法和生物膜過濾制備出核桃多肽營養液，具有較高的抗氧化活性。

縱觀國內外，核桃多肽的制備研究都還限于初級探索階段，針對其生理活性、分子結構等方面也沒有較為深入的研究。因此全面研究核桃多肽的制備方法和生理功能，并開發相應的產品，無論是對提高核桃餅粕蛋白的藥用價值，還是對豐富保健品來源，都具有重要的現實意義。

4.2在食品方面的應用

核桃餅粕蛋白質可作為原料用來生產高蛋白核桃粉、核桃多肽酒、核桃蛋白醬、核桃醬油等產品，也可作為食品添加劑，被廣泛應用于食品工業中。它具有藥食同源性，可以改善食品原有品質。

現今關于核桃粉的制備方法已經較為成熟，以冷榨核桃餅粕為原料，可按照如下流程[18]生產出高蛋白脫脂核桃粉：核桃餅粕→破碎→磨漿→過濾→配料→膠體磨細化→殺菌→濃縮→均質→噴霧干燥→高蛋白脫脂核桃粉。以新疆優質山核桃脫脂粕為原料，可通過如下流程[38]生產出符合國家標準的高蛋白營養核桃粉：脫脂核桃粕→粉碎→乳化劑、穩定劑加水調配→均質→噴霧干燥→成品。這2種工藝生產出的核桃蛋白粉不僅在溶解性、蛋白質含量、外觀色澤等方面優于市場同類產品，而且感官品質也較為優良。郝劍等[11]研制出以核桃餅粕為原料的微膠囊速溶核桃粉的加工技術，可以有效防止油脂氧化，延長貨架期。LABUCKAS等[27]優化了螺旋榨油機溫度與螺桿轉速的條件，改善了脫脂核桃粉中蛋白質的溶解度和持水性。

姜莉等[39]以核桃餅粕為原料，經過酶解、發酵、過濾、滅菌等過程，制備出口感良好的核桃多肽酒。AYO等[40]和COFRADES等[41]研究認為，將核桃餅粕蛋白質作為天然蛋白成分填充到肉制品中，可顯著提高肉制品的蛋白質含量以及吸水性、吸油性。JIMéNEZ等[42]在牛排中添加核桃蛋白質，改善了肉質的生化和感官特點。藺立杰[43]利用核桃餅粕和麩皮為原料，優化了制曲工藝和發酵工藝成功生產出具有特色風味的核桃醬油，且具有較強的抗氧化作用和ACE(血管緊張素轉化酶)抑制活性。

4.3在其他方面的應用

核桃餅粕蛋白質營養價值高，作為綠色的有機肥料，不僅可以為作物提供養料、提高抗性，還能改良土質現狀，保持土壤溫度，有助于提高其肥沃度。而作為高蛋白飼料，核桃餅粕蛋白質干物質和粗纖維含量均高于其他同類飼料，且富含多種維生素及微量元素，適用于各種畜禽。

5討論與展望

我國作為核桃栽培大國，每年榨油所產生的核桃粕數量極為龐大，提取核桃餅粕蛋白資源供后續加工利用是利用核桃資源的一條重要途徑。目前關于核桃餅粕蛋白質的綜合利用方面僅有少量研究，有關核桃餅粕深加工技術也只是停留在實驗室研究階段，未能應用于實際生產。

如今在核桃餅粕蛋白質提取方面，大多參照大豆餅粕蛋白質提取方法，但以谷蛋白為主要組分的核桃蛋白與以球蛋白為主要組分的大豆蛋白性質不同，因此提取方法也不能照搬大豆蛋白的提取方法。此外，酸沉法制備核桃濃縮蛋白具有操作簡便、易于控制、得率高等優點，具有廣闊前景，經工藝優化后制品蛋白質含量理論上可達80%左右，高于70%的普通標準，但目前仍未形成標準化的工藝流程。而核桃分離蛋白制備法因制品純度高而得到廣泛研究，但是傳統的堿溶酸沉法存在蛋白得率低、影響因素多、過程不易控制、制品色澤較深等問題，難以獲得最佳的提取工藝。因此，筆者認為進一步研究應集中在以下幾方面：(1)在傳統堿溶酸沉法的基礎上，以當前已有的優化方法作為參照，繼續探索變性程度小、得率高的制備方法；(2)探究不同來源的核桃餅粕及不同蛋白質提取工藝對蛋白制品功能特性的影響；(3)推廣高純度核桃蛋白制品在醫藥、食品工業上的應用。

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Development and utilization of walnut meal protein

JIN Zi-chun, ZHANG Run-guang, HAN Jun-qi, MA Le, YANG Xi,WANG Xu-lin, ZHANG You-lin*

(College of Food Engineering and Nutritional Science of Shaanxi NormalUniversity， Xi′an 710119, China)

ABSTRACTAs an excellent resource of proteins, walnut meal protein contains abundant glutamic acid, aspartic acid and arginine. They play an important role in human health care. However, it is often discharged or sold at a very low price, which wastes a lot of good protein resource. Therefore, high efficient extracting walnut meal protein and widely applying in the food industry has a great significance on utilization of the material. The preparation technique and functional characteristics of walnut meal protein were introduced in detail. Moreover, the recent development and utilization were also summarized.

Key wordswalnut meal protein; preparation and purification; functional characteristics; development and utilization

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606046

基金項目：西安市現代農業創新計劃項目(NC1317.3，NC1405.2)

收稿日期：2015-10-08，改回日期：2015-12-12

第一作者：碩士研究生(張有林教授為通訊作者，E-mail：youlinzh@snnu.edu.cn)。