祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠腎小球內皮細胞通透性的影響

王　娟，　崔志軍，　馬巧亞，　孫萬森，　王　竹

(1.西安交通大學醫學院第二附屬醫院，　陜西　西安　710004 2.陜西省交通醫院急診科，　陜西　西安　710068)

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祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠腎小球內皮細胞通透性的影響

王娟1，崔志軍2，馬巧亞1，孫萬森1，王竹1

(1.西安交通大學醫學院第二附屬醫院，陜西西安710004 2.陜西省交通醫院急診科，陜西西安710068)

【摘要】目的：探討祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠腎小球內皮細胞通透性的影響。方法：一次性尾靜脈注射阿霉素建立大鼠腎病模型。采用全自動生化分析儀檢測24h尿蛋白定量、血清生化指標；采用酶聯免疫吸附測定試劑盒測定腎小球內皮細胞培養上清血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平；采用二室彌散系統檢測腎小球內皮細胞通透性。結果：尿蛋白定量降低，血清白蛋白升高，血總膽固醇降低，腎小球內皮細胞培養上清VEGF降低，腎小球內皮細胞通透性降低。結論：祛風通絡方可能通過下調阿霉素腎病大鼠腎小球內皮細胞VEGF表達，降低腎小球內皮細胞通透性，從而達到防治蛋白尿的目的。

【關鍵詞】祛風通絡方；蛋白尿；腎小球內皮細胞；血管內皮生長因子；通透性

蛋白尿是多種腎臟疾病的主要臨床表現之一，蛋白尿程度與腎小球濾過膜通透性密切相關。本課題前期研究證實，祛風通絡方可通過調節阿霉素腎病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠足細胞相關蛋白表達發揮防治蛋白尿的作用，但祛風通絡方對GEC通透性的影響尚未明確[1]。本研究擬以AN大鼠為動物模型，探討祛風通絡方對AN大鼠腎小球內皮細胞通透性的影響，旨在為祛風通絡方的臨床治療提供可靠依據。

1材料與方法

1.1動物與藥品:SPF級成年雄性SD大鼠48只，體重140g～160g，購于西安交通大學醫學院動物實驗中心(合格證號為陜醫動字第09-005號)；阿霉素購于浙江海正藥業，規格：10mg，國藥準字H33021980；醋酸潑尼松購于廣東華南藥業集團有限公司，批號：國藥準字H44020682，規格：5mg；祛風通絡方由西安交通大學第二附屬醫院中醫科制劑室提供，方中包含黃芪、生地、青風藤、桑寄生、烏梢蛇、海風藤，每劑含生藥105g。

1.2實驗試劑及儀器:胎牛血清、RPMI1640培養基、PBS緩沖液(Hyclon公司，美國)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)ELISA檢測試劑盒(R&D公司，美國)；7600-020型全自動生化分析儀(日立公司，日本)；酶標儀(Thermo公司，美國)。

1.3動物模型建立及分組:將48只大鼠按簡單隨機分組法分為空白對照組(A組，n=8)和腎病模型組(G組，n=40)，參照任艷云[2]等報道方法，采用一次性尾靜脈注射阿霉素6mg/kg建立大鼠腎病模型，A組給予尾靜脈注射等量生理鹽水。3周后檢測大鼠24h尿蛋白定量、血清白蛋白(albumin，ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(creatinine，Cr)、血總膽固醇(total cholesterol，TC)、血甘油三酯(triglyceride，TG)指標，提示造模成功(見表1)。將G組40只腎病模型大鼠按簡單隨機分組法分為5組，即B組、C組、D組、E組、F組，每組8只。B組為模型對照組，C、D、E組為祛風通絡方干預組，F組為陽性對照組。從第4周期，A組和B組僅給予生理鹽水，C、D、E組分別給予含生藥量1.0g/mL、2.1g/mL、4.2g/mL的祛風通絡方2mL(分別相當于成人臨床用藥的6倍、12倍、24倍)，F組給予25mg/kg潑尼松液2mL(相當于成人劑量4倍)，各組均采用灌胃給藥，1次/d，連續給藥28d。實驗結束時，處死所有受試動物。

1.4腎小球內皮細胞分離培養:參照曾玉[3]等報道方法，分離培養腎小球內皮細胞。活體取出大鼠腎臟，去除腎被膜及髓質，輕輕碾磨皮質，并依次通過80目、120目、200目篩子，收集腎小球。加入0.1%IV型膠原酶消化腎小球，收集沉淀，將腎小球接種與鋪有1%明膠培養瓶，常規培養，待腎小球充分貼壁后常規換液，第3周進行純化。采用MiniMACS間接免疫磁珠分選系統分離純化CD34陽性細胞，純化后細胞常規培養并傳代，采用形態學觀察、直接免疫熒光法及免疫組化法對所分離內皮細胞進行鑒定。

1.5腎小球內皮細胞通透性測定:參照陳朝紅[4]等報道方法，進行腎小球內皮細胞通透性檢測。調整內皮細胞濃度為3.0×105個/mL并接種于微孔細胞培養嵌套中，將嵌套置于6孔培養板中，加入1640培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每天換液一次，待濾膜上內皮細胞生長成致密連接狀態后，加入100mg/L biotin-BSA作為通透性指示劑，收集培養12h時內室和外室培養液各10μL，測定biotin-BSA含量。內皮細胞單層對白蛋白的通透性計算公式=(外室biotin-BSA濃度/內室biotin-BSA濃度)×100%。

1.6血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)測定：采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒測定腎小球內皮細胞培養上清VEGF水平，操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.724h尿蛋白測定:采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽法檢測24h尿蛋白定量。

1.8血清生化指標:采用全自動生化分析儀監測血清ALB、BUN、Cr、TC、TG等指標。

2結果

2.1各組7周末24h尿蛋白定量比較:各組間7周末24h尿蛋白定量比較差異顯著(F=20.421，P<0.05)。與B組比較，C、D、E、F組24h尿蛋白定量降低，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)；C、D、E組三組間24h尿蛋白定量比較無統計學意義(P>0.05)；C、D、E組三組間24h尿蛋白定量與F組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表1　各組3周末24h尿蛋白定量及血清各項指標比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表2　各組7周末24h尿蛋白定量比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.2各組7周末血清各項指標比較:各組間7周末ALB、Cr、TC、TG比較差異顯著(F=15.368、7.213、35.247、44.619，P<0.05)。各組間7周末BUN比較無統計學差異(F=0.734，P>0.05)；與A組相比較，B組ALB明顯降低，Cr、TC、TG明顯升高，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E組ALB升高，TC降低，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。C、D、E組三組間ALB、Cr、TC、TG比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3　各組7周末血清各項指標比較±s)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.3各組腎小球內皮細胞VEGF表達水平比較:各組間7周末腎小球內皮細胞VEGF表達水平比較差異顯著(F=14.682，P<0.05)。與A組相比較，B組腎小球內皮細胞VEGF水平明顯升高，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E、F組腎小球內皮細胞VEGF明顯降低，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。C、D、E組三組間腎小球內皮細胞VEGF比較差異無統計學意義(P>0.05)。C、D、E組三組間腎小球內皮細胞VEGF與F組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1)。

圖1　各組腎小球內皮細胞VEGF表達水平比較示意圖

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

2.4各組腎小球內皮細胞通透性比較:各組間腎小球內皮細胞通透性比較差異顯著(F=28.335，P<0.05)。與A組相比較，B組腎小球內皮細胞通透性明顯升高，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。與B組相比較，C、D、E、F組腎小球內皮細胞通透性降低，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。C、D、E組三組間腎小球內皮細胞通透性比較無統計學意義(P>0.05)。C、D、E組三組間腎小球內皮細胞通透性與F組比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見圖2)。

圖2　各組腎小球內皮細胞通透性比較示意圖

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05

3討論

腎小球內皮細胞作為腎臟濾過屏障的重要組成部分，其通透性增高是誘發蛋白尿的獨立危險因素。腎小球內皮細胞通透性改變的機制較為復雜，VEGF的靶向作用是其中的重要機制之一。VEGF作為強大的血管通透因子，主要分布于腎小球足細胞及腎小管上皮細胞中，其在腎臟中的作用機制尚未完全明確，目前認為VEGF可通過旁分泌作用，穿透腎小球基膜，作用于腎小球內皮細胞，從而調節腎小球濾過膜通透性。陳朝紅[5]等分別選取腎小球內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞為研究對象，并觀察VEGF體外刺激對二者通透性的影響，結果顯示VEGF體外刺激可明顯提高腎小球內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞通透性，且腎小球內皮細胞對VEGF的敏感性明顯高于人臍靜脈內皮細胞，證實VEGF在腎臟疾病及蛋白尿的發生與發展中發揮重要作用。

本研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素法成功建立大鼠腎病模型，并在此基礎上觀察大鼠腎小球內皮細胞VEGF表達及通透性的影響。結果表明祛風通絡方和潑尼松對阿霉素腎病大鼠蛋白尿均有明顯的治療作用，且祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠蛋白尿的治療作用與潑尼松相當，但并無潑尼松的副作用。不同濃度祛風通絡方的干預效果無明顯差異。此外，祛風通絡方可顯著抑制阿霉素腎病所致的腎小球內皮細胞通透性增高，其抑制效果與潑尼松相當，該結果為祛風通絡方拮抗阿霉素腎病大鼠蛋白尿提供了可靠佐證。祛風通絡方均可明顯下調阿霉素腎病所致的VEGF高表達，且各組VEGF變化趨勢與腎小球內皮細胞通透性變化趨勢相符，提示祛風通絡方可能是通過調節VEGF表達達到降低腎小球內皮細胞通透性的目的。

中醫認為，脾腎兩虛是腎性蛋白尿的主要病機。筆者認為“風伏腎絡”是腎性蛋白尿的另一重要病機。本虛乃腎絡空虛，標實乃四時邪氣。依據此病機，應以“補虛祛邪”之法以填補腎絡之空虛，驅逐當令之邪。祛風通絡方是在“風伏腎絡”病機指導下經多年臨床實踐加減而成的中藥復方。方中以烏梢蛇為君，具有祛風通絡、止痙鎮痛之功效。現代藥理學研究證實，烏梢蛇可明顯增強網狀內皮系統吞噬能力，對蛋白尿具有較好的治療效果。海風藤為臣，具有祛風通絡、行氣止痛之功效。君臣互補，可搜腎絡之伏風、通腎絡之瘀滯。佐以黃芪、桑寄生，可補腎健脾、利水消腫。縱觀全方，共奏祛風通絡、補氣益腎之功效，契合腎性蛋白尿“風伏腎絡”之病機和本虛標實的病性。 綜上所述，祛風通絡方可能通過下調阿霉素腎病大鼠腎小球內皮細胞VEGF表達，降低腎小球內皮細胞通透性，從而達到防治蛋白尿的目的。

【參考文獻】

[1]王竹,劉俊田,孫萬森,等.祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠足細胞Desmin及CD2AP蛋白的影響[J].中國中西醫結合雜志,2014,34(2):203～208.

[2]任艷蕓,孫萬森,趙艷龍,等.祛風通絡方對阿霉素腎病大鼠腎小球足細胞nephrinmRNA表達的影響[J].中南大學學報(醫學版),2009,34(12):1216～1223.

[3]曾玉,鄧紅,周曉軍,等.大鼠腎小球內皮細胞分離培養和鑒定[J].中華病理學雜志,2005,34(4):233～234.

[4]陳朝紅,劉志紅,余晨,等.一種體外研究腎小球內皮細胞通透性的方法[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2002,11(5):497～500.

[5]陳朝紅,劉志紅.血管內皮細胞生長因子對腎小球內皮細胞通透性的影響[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2002,11(4):353～357.

【基金項目】國家青年自然科學基金，(編號：81001579)；西安交通大學基本科研業務費自由探索與自主創新類項目，(編號：08143035)；西安交通大學醫學院第二附屬醫院院基金重點項目，[編號：YJ(ZD)201203]

【通訊作者】王竹

【文章編號】1006-6233(2016)06-0957-04

【文獻標識碼】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.028