參芎葡萄糖注射液對肝臟6種亞型微粒體細胞色素P450酶的抑制作用*

孫　佳, 陸　苑, 潘　潔, 鄭　林, 黃　勇, 王永林, 李勇軍1,**

(1.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽　550004； 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽　550004； 3.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽　550004； 4.貴州醫科大學 國家苗藥工程技術研究中心， 貴州 貴陽　550004)

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參芎葡萄糖注射液對肝臟6種亞型微粒體細胞色素P450酶的抑制作用*

孫佳1,2,3,4, 陸苑2,3, 潘潔3, 鄭林2,3, 黃勇2,3, 王永林2,3, 李勇軍1,3**

(1.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽550004； 2.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室， 貴州 貴陽550004； 3.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽550004； 4.貴州醫科大學 國家苗藥工程技術研究中心， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 考察參芎葡萄糖注射液對人肝微粒體細胞色素P450(CYP450)酶6種亞型CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的體外抑制作用。方法： 在人肝微粒體孵育系統中，將不同濃度的參芎葡萄糖注射液和7種混合探針底物(非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、右美沙芬、睪酮和咪達唑侖)共同孵育，采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)同時測定孵育液中CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶對應代謝物(對乙酰氨基酚、6-羥基氯唑沙宗、羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、6β-羥基睪酮和α-羥基咪達唑侖)的剩余量，與對照組進行比較，得到酶的剩余活性，用GraphPad v5.0軟件計算半抑制濃度(IC50)值，考察參考葡萄糖注射液對人肝微粒體CYP450酶的抑制程度。結果: 在人肝微粒體孵育體系中，參芎葡萄糖注射液對6種CYP450亞型酶的IC50值均>15%。結論: 在臨床劑量下，參芎葡萄糖注射液對人肝微粒體CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4無明顯抑制作用。

[關鍵詞]參考葡萄糖注射液； 細胞色素P450； 微粒體，肝； 藥物相互作用

隨著臨床聯合用藥的日益普遍，由藥物相互作用引發的不良反應逐年遞增，因此，開展藥物相互作用研究已引起高度重視，其應用價值和重要意義不容忽視。在人類代謝酶系統中，細胞色素P450(CYP450)是最重要的一種超基因家族酶，90%以上臨床常見藥物均需通過CYP450酶系進行I相代謝[1]，且藥物代謝酶被抑制約占代謝性藥物相互作用的70%[2]。參芎葡萄糖注射液是由丹參和鹽酸川芎嗪配伍組成的中藥注射液品種，具有抗血小板聚集、擴張冠狀動脈作用，還降低血液黏度，改善微循環，具有抗心肌缺血和心肌梗死的作用，臨床廣泛用于治療閉塞性腦血管病及其他缺血性血管疾病[3-5]。參芎葡萄糖注射液與其他藥物聯合用藥的情況也相當普遍，因藥物間相互作用所帶來的用藥風險也不斷增大。有關參芎葡萄糖注射液對CYP450抑制作用的研究未見報道。為了排除種屬間的差異，本研究特采用人肝微粒體研究參芎葡萄糖注射液對CYP450酶6種亞型的體外抑制作用，以預測其是否會導致潛在的代謝性藥物相互作用[6]，這將有助于提高臨床用藥的安全性和有效性。

1實驗方法

1.1實驗儀器與材料

Waters超高液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀；Beckman Allegra 64R低溫高速離心機；Thermo 700系列超低溫冰箱；CS501A超級恒溫水浴箱。參芎葡萄糖注射液(規格100 mL，批號20131125)由貴州景峰注射劑有限公司提供，非那西丁、奧美拉唑、甲苯磺丁脲和睪酮(批號分別為81105、90925、20321、10519)均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，右美沙芬(批號090M1298V)購于美國Sigma公司，咪達唑侖注射液購于江蘇恩華藥業股份有限公司，氯唑沙宗和對乙酰氨基酚(批號分別為100364-200301、100018-200408)購于中國食品藥品檢定研究院，右啡烷、羥基甲苯磺丁脲、5-羥基奧美拉唑、6-羥基氯唑沙宗和6β-羥基睪酮(批號分別為1-ALN-64-2、1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、6-QFY-28-2、KIT0635)購于加拿大TRC公司，α-羥基咪達唑侖(批號FN101512-07)購于美國Cerilliant公司，人肝微粒體購于美國BD公司。NADP+購于Roche公司，G-6-P，G-6-PD購于Sigma公司，乙腈購于德國默克試劑公司。其他無機鹽均為分析純，甲醇為色譜純。

1.2方法1.2.1液相條件色譜柱Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)柱，流速0.35 mL/min，柱溫 45 ℃，流動相 0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，檢測7種專一性代謝產物的梯度條件為0～3.0 min 5%～65% A，3.0～3.5 min 65%～90% A，3.5～4.5 min 10% A；進樣體積為 1 μL[7]。

1.2.2質譜條件電噴霧電離源(ESI)，毛細管電壓 3 kV，離子源溫度 120 ℃，去溶劑氣溫度 350 ℃。去溶劑氣 N2，流速 650 L/h；反吹氣 N2，流速 50 L/h；碰撞氣 Ar，流速 0.16 mL/min；質譜數據采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站，掃描方式為多反應離子監測模式(MRM)，離子對條件見表1[7]。

表1　質譜條件

1.2.3參芎葡萄糖注射液對CYP450的6種亞型酶的IC50值體外孵育系統的終體積為200 μL，包括含肝微粒體蛋白0.5 g/L，NADP+20 g/L，G-6-P 20 g/L，MgCl213.3 g/L，G-6-PD 40 U/mL，甲苯磺丁脲100 μmol/L、氯唑沙宗50 μmol/L、咪達唑侖25 μmol/L、睪酮100 μmol/L、右美沙芬50 μmol/L、奧美拉唑50 μmol/L和非那西丁50 μmol/L，以及不同濃度(注射液占孵育體系的0.25%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%和15.0%)的參芎葡萄糖注射液，其余為的0.1 mol/L PBS緩沖溶液(pH=7.4)。將不同濃度參芎葡萄糖注射液分別和NADPH再生系統、肝微粒體和PBS溶液于37 ℃預孵育3 min，再加入混合探針底物開始反應，孵育時間為60 min，其中有機試劑占反應體系的終濃度不得超過1% (V/V)。對照組加入等體積的葡萄糖注射液代替，每個樣品平行操作3次，反應結束后加入100 μL冰冷的甲醇終止反應，再加入冰冷的葛根素內標(2 mg/L)溶液100 μL，渦混均勻后超聲3 min，15 000 r/min離心10 min，用UPLC-MS/MS定量按照“1.2.1”和“1.2.2”項下分析7種探針藥物對應的代謝物(羥基甲苯磺丁脲、6-羥基氯唑沙宗、α-羥基咪達唑侖、6β-羥基睪酮、右啡烷、5-羥基奧美拉唑和對乙酰氨基酚)。分析結果使用GraphPad v5.0軟件作圖，并計算出相對應CYP450酶活性的半抑制濃度(IC50值)。

2結果

孵育液中參芎葡萄糖注射液體積分數在15%以內對CYP450的6個亞型酶活性的抑制作用非常弱，GraphPad v5.0軟件無法擬合出其IC50值。見圖1。

圖1　參芎葡萄糖注射液對6種亞型CYP450酶的抑制曲線(n=3)Fig.1　Inhibition curve of Shenxiong glucose injection on 6 cytochrome P450 isoforms

3討論

在藥品說明書中，參芎葡萄糖注射液每100 mL參芎葡萄糖注射液分別含有20 mg丹參素和100 mg鹽酸川芎嗪，其他主要成分分別是原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A[8]。參芎葡萄糖注射液臨床常用劑量為100～200 mL/d，粗略地按人體血液為5 L計算，參芎葡萄糖注射液在血液中的體積百分比濃度最多為2%～4%，而實驗結果表明參芎葡萄糖注射液對CYP450酶6種亞型的IC50值均大于15%，這濃度遠超過臨床劑量，說明參芎葡萄糖注射液對人CYP450無抑制作用。

CYP450酶活性被抑制或被誘導表達是導致藥物代謝相互作用的主要原因，其中酶活性被抑制導致的藥物相互作用的臨床意義更為重要，當一種藥物抑制某種特定亞型酶活性，會導致其他通過該亞型酶代謝的藥物血藥濃度明顯升高，如果是治療窗窄的藥物，如華法林(CYP2C9特異性底物)，則會發生嚴重地藥物不良反應，甚至導致死亡。石杰[9]發現川芎嗪對大鼠肝藥酶CYP1A2和CYP3A4均無影響。李峰[10]研究表明3種劑量的川芎嗪(50 mg/kg、100 mg/kg和300 mg/kg)對大鼠的肝重、微粒體產率、CYP450含量及NADPH Cyt C還原酶活性均無明顯影響。雖然，存在種屬差異，但這也佐證本實驗結果。有報道表明丹參中的多種成分，如丹參總酚酸、丹參酮IIA對大鼠CYP450具有誘導作用[11-12]。并且，以丹參為主要原料藥的復方丹參滴丸和復方丹參片對大鼠CYP450具有明顯的誘導作用[13-15]。因此，需要進一步進行大鼠體內實驗，考察參芎葡萄糖注射液是否具有誘導作用。

為了降低個體和避免種屬間的差異，本實驗采用人混合肝微粒體作為研究對象。本研究結果表明參芎葡萄糖注射液對人CYP450無明顯抑制作用，因此臨床上多種藥物與參芎葡萄糖注射液聯合使用時，由抑制作用而產生的藥物不良反應風險不大。

4參考文獻

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(2016-02-25收稿，2016-05-14修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華

*[基金項目]國家科技支撐計劃課題(2013BAI11B01)； 貴州省科技重大專項項目[黔科合重大專項字(2011)6019號]； 貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項[黔科合ZY字(2013)3020號;黔科合中藥字(2013)5062號]； 貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項[黔科合重G字(2013)4001]

[中圖分類號]R969.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)07-0775-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.07.007

InvitroInhibition Effects of Shenxiong Glucose Injection on 6 Cytochrome P450 Isoforms in Human Liver Microsome

SUN Jia1,2,3,4, LU Yuan2,3, PAN Jie3, ZHENG Lin2,3, HUANG Yong2,3, WANG Yonglin2,3, LI Yongjun1,3

(1.EngineeringResearchCenterofMinistryofEducationfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China. 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao'sMedicines,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To evaluate the in vitro inhibition effects of Shenxiong glucose injection on 6 cytochrome P450 isoforms (CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4) in human liver microsome. Methods: Shenxiong glucose injection were incubated with human liver microsomes in the presence of 7 probe substrates for CYP450 isoforms, including phenacetin for CYP1A2, chlorzoxazone for CYP2E1, tolbutamide for CYP2C9, omeprazole for CYP2C19, dextromethorphan for CYP2D6, testosterone and midazolam for CYP3A4. Meanwhile, UPLC-MS/MS was adopted to measure remaining content of corresponding metabolite of CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 (Acetaminophen, chlorzoxazone 6-hydroxylation, hydroxytolbutamide, 5-hydroxy omeprazole, dextrorphan, 6 beta hydroxy testosterone and alpha hydroxy midazolam of midazolam). By comparison with control group, the remaining enzyme activities of cytochrome P450 isoforms were calculated. IC50 values were calculated by GraphPad v5.0 program to evaluate the inhibitory effects. Results: IC50values of Shenxiong glucose injection on CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 were more than 15%. Conclusion: Shenxiong glucose injection don't show inhibitory effect on CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 in human liver microsome.

[Key words]shenxiong glucose injection; cytochrome P450; microsomes，liver; drug interaction

**通信作者 E-mail:392828662@qq.com; liyongjun026@126.com

網絡出版時間：2016-07-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160717.1318.012.html