常山酮抑制乳腺癌腦轉移的作用研究

王丹丹　宋寧寧　亢春彥　陳建中

1)鄭州大學第二附屬醫院乳腺外科　鄭州　450014　2)河南醫學高等專科學校病理學教研室　新鄭　451191

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常山酮抑制乳腺癌腦轉移的作用研究

王丹丹1)宋寧寧1)亢春彥2)陳建中1)

1)鄭州大學第二附屬醫院乳腺外科鄭州4500142)河南醫學高等專科學校病理學教研室新鄭451191

【摘要】目的探討常山酮抑制乳腺癌腦轉移的作用。方法本實驗分為溶劑組及常山酮組，以人乳腺癌細胞MDA-MB-231及BALB裸鼠為研究對象，首先通過體外實驗，使用MTT法、劃痕試驗及Western blot觀察各組MDA-MB-231增殖、遷移及bax、bcl-2、cleaved-caspase3等凋亡相關蛋白的表達情況；然后制備乳腺癌腦轉移模型，通過神經功能評分及腦部HE染色觀察各組腦轉移情況。結果常山酮顯著抑制了MDA-MB-231的增殖和遷移能力，增加了bax及cleaved-caspase3蛋白的表達水平，并減少了MDA-MB-231向腦部的定植。結論常山酮可能通過抑制細胞增殖及遷移、促進凋亡等機制抑制乳腺癌細胞腦轉移。

【關鍵詞】乳腺癌；腦轉移；常山酮

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，尤其在發展中國家[1]。腦轉移是乳腺癌后期常見的轉移癌類型，由于存在血腦屏障(blood brain barrier，BBB)，大多數抗癌藥物都不可以到達顱內轉移灶發揮作用，導致乳腺癌腦轉移生存率極低，嚴重影響乳腺癌患者預后[2]。特別隨著近些年癌癥研究的巨大進步，乳腺癌患者的生存期有所延長，腦轉移的發生率正在增加。尋找能夠通過血腦屏障的高效抗癌藥物對乳腺癌腦轉移的治療具有巨大的現實意義。常山酮為一種小分子生物堿，從我國傳統中藥常山中提取，之前主要應用于預防及治療禽類球蟲病。但近十幾年，國內外多項高質量研究證實，常山酮具有較為廣譜的抗癌效果，能夠抑制黑色素瘤、肝癌、膀胱癌及乳腺癌等發展[3]。研究表明，常山酮能夠通過血腦屏障，且可以通過抑制基質金屬蛋白酶的活性、抑制轉化生長因子β受體信號通路發揮綜合的抗癌效果[4-5]，但常山酮能否抑制乳腺癌腦轉移尚缺乏研究。本實驗旨在探討常山酮對乳腺癌腦轉移的治療效果，并初步探討其內在機制。

1材料與方法

1．1實驗材料及分組本實驗使用裸鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，6周齡，體質量16～22 g)購于南京大學模式動物研究所；人乳腺癌細胞MDA-MB-231購于美國ATCC公司。常山酮購于美國Sigma公司。抗bax、cleaved-caspase3及GAPDH購自Santa Cruz 公司。MTT試劑盒購于中國康為試劑公司。本研究分為溶劑組及常山酮組。

1．2MTT試驗使用MTT試驗測定人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖情況。首先，將MDA-MB-231以1×104的密度接種于24孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養于含10%胎牛血清的DMEM中24 h，之后分別加入DMEM及常山酮(終濃度為100 nM)，再繼續培養48 h。然后吸出上清，以終濃度62.5 μg/mL加入MTT，在37 ℃、5% CO2條件下培養4 h，吸出上清，加入DMSO后再將上清取出，在570 nm波長下觀察吸收值，每組重復8次。

1．3劃痕試驗使用劃痕試驗測定人乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移能力。將MDA-MB-231接種于24孔板，于37 ℃、5% CO2條件下培養細胞至生長到90%左右，用200 μL槍頭在2組培養孔底部自上而下畫一條豎線，然后分別加入DMEM及常山酮(終濃度為100 nM)。37 ℃、5% CO2條件條件下培養24 h后拍照觀察，并使用Image J軟件計算2組劃痕兩側細胞之間的平均距離。每組重復8次。

1．4Western blot使用Western blot方法測定人乳腺癌細胞MDA-MB-231bax及cleaved-caspase3的表達情況。劃痕試驗中計算完劃痕兩側細胞間的平均距離后，提取各組細胞全蛋白，于12%的SDS-PAGE中分離，之后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后分別加入抗-bax及抗cleeaved-caspase3抗體，于室溫下孵育2 h，PBST清洗后加入對應二抗，于室溫下孵育1.5 h，清洗后加入ECL發光液，在化學發光顯示儀器中觀察各組各蛋白的情況，使用Image J測定各組條帶密度情況。每組重復8次。

1．5乳腺癌腦轉移模型制作以20只雌性BALB/c-nu/nu裸鼠為研究對象，依據Taskar等[5]的方法麻醉小鼠后，打開胸腔，向其左心室注射1.75×105MDA-MB-231人乳腺癌細胞，縫合傷口，5周時通過改良的神經功能評分(mNSS)及腦部切片HE染色觀察裸鼠神經功能體征及明確乳腺癌腦轉移情況。溶劑組及常山酮組分別在手術時開始隔天腹腔注射DMEM及常山酮50 mg/kg至實驗結束。

2結果

2．1常山酮對MDA-MB-231細胞增殖、遷移的影響常山酮(100 nM)顯著抑制了MDA-MB-231細胞的增殖及遷移能力。見表1。

表1　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231

注：與溶劑組相比，*P<0.05

2．2常山酮對MDA-MB-231細胞凋亡的影響常山酮(100 nM)顯著促進了MDA-MB-231細胞的凋亡。見圖1及表2。

圖1　2組bax、cleaved-caspase3表達情況

組別Bax/GAPDHCleavedcaspase3/GAPDH溶劑組0.131±0.020.219±0.03常山酮組0.423±0.06*0.691±0.07*

注：與溶劑組相比，*P<0.05

2．3常山酮對MDA-MB-231細胞向腦部定植能力的影響常山酮(50 mg/kg)抑制了MDA-MB-231向腦部定植能力。見表3。

表3　常山酮對MDA-MB-231向腦部定植

注：與溶劑組相比，#P<0.05

3討論

因存在血腦屏障，目前大多數抗癌藥物對乳腺癌腦轉移無效，目前臨床上多使用全腦放療配合化療的治療方式改善患者神經系統功能障礙[6]，療效雖然肯定，但存在復發快及化療不良反應等問題，導致乳腺癌腦轉移患者生存率極低[7]。

乳腺癌細胞能夠促進基質金屬蛋白酶的分泌量及活性，其能夠溶解組織中及血管的基質，進而促進乳腺癌轉移；乳腺癌細胞也能夠促進周圍炎癥細胞分泌生長轉換因子β等細胞因子，這些細胞因子參與癌細胞的增殖、分化及遷移和血管新生過程，最終導致乳腺癌轉移[8]。常山酮為一種小分子生物堿，國內外學者首先發現其能夠通過抑制基質金屬蛋白酶的活性進而具有抗纖維化的能力，之后又發現其能夠抑制生長轉化因子β下游信號通路作用而廣泛應用于抗腫瘤研究[3，9-10]。如上所述，基質金屬蛋白酶及生長轉化因子β在腫瘤的發生發展過程中作用巨大。常山酮還被證實能夠通過血腦屏障到達腦內，因此常山酮可能為乳腺癌腦轉移的理想藥物之一。

本研究首先利用體外培養的方式，探討常山酮對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖、遷移及凋亡的影響。本研究發現常山酮(100 nM)能夠顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖及遷移能力，且顯著下調了凋亡蛋白bax及cleaved-caspase3的水平，說明常山酮具有抑制乳腺癌發展的能力；然后采用制作乳腺癌腦轉移模型的方法，在將MDA-MB-231細胞注射至裸鼠外周血中的同時開始對其應用常山酮(50 mg/kg)，發現常山酮能夠顯著減少MDA-MB-231細胞向腦部的定植作用，提示常山酮可能能夠遷移至腦部、預防并治療乳腺癌的腦轉移。然而常山酮預防、治療乳腺癌腦轉移的劑量-反應關系、具體分子機制、有無不良反應等問題仍需進一步研究。

4參考文獻

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(收稿 2016-05-22)

【中圖分類號】R737.9

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)15-0039-02