裂殖壺菌菌株FJU-512油脂提取的細胞破壁工藝

何文勝，王　燦，楊詩穎

(1.福建生物工程職業技術學院，福建福州350002；2.福建師范大學 生命科學學院，工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心，福建福州350117)

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·研究簡報·

裂殖壺菌菌株FJU-512油脂提取的細胞破壁工藝

何文勝1,2*，王燦2，楊詩穎2

(1.福建生物工程職業技術學院，福建福州350002；2.福建師范大學 生命科學學院，工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心，福建福州350117)

摘要：裂殖壺菌(Schizochytrium)是目前用于商業化生產二十二碳六烯酸(DHA)的高產菌種之一，由于DHA屬于胞內油脂，因此對其進行充分破壁是工業化提取DHA的關鍵工序.研究了酸熱法、堿熱法、超聲波法以及酶法對裂殖壺菌細胞破壁的影響，考察了不同破壁方法提取得到的總油脂及DHA產量，結果表明酶法是最優破壁方法.繼而探討不同單一酶破壁的總油脂產量，并將破壁效果最好的堿性蛋白酶和其他酶進行比較，確定最佳用酶為堿性蛋白酶.為進一步完善酶法破碎裂殖壺菌細胞的效果以提高總油脂產量，對堿性蛋白酶酶解的溫度、pH、時間以及酶用量等條件進行優化.正交試驗結果表明，堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶用量2.0%，溫度55 ℃，pH 10.0，酶解時間2.0 h.在此優化條件下，裂殖壺菌菌株FJU-512的每克菌體細胞總油脂產量達到0.458 6 g.

關鍵詞：裂殖壺菌；提取；油脂；酶法破壁

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種重要的ω-3系列長鏈多不飽和脂肪酸，在人類大腦皮層、視網膜、睪丸以及精子中含量很高，是大腦結構脂肪酸不可或缺的成分之一[1-2]，具有增強記憶力、提高智力、降低血壓和血脂、預防老年癡呆[3-4]、延緩衰老[5]等功能，是一種重要的功能保健因子.

裂殖壺菌(Schizochytrium)是一類單細胞海洋真菌，是目前商業化生產DHA的菌種之一，其安全性已經得到美國食品和藥品部(FDA)的認可，可廣泛應用于嬰幼兒配方食品、孕期和哺乳期婦女食品及功能性食品[6].裂殖壺菌菌株FJU-512是本實驗室分離獲得的一株具獨立知識產權的DHA 高產菌株[7]，該菌株生長速度較快，脂肪酸組成簡單，DHA 含量高且易純化[8]，可作為DHA油脂相關研究的優勢菌株.DHA主要以甘油酯的形式存在于裂殖壺菌細胞內，為了獲取胞內油脂，首先需進行裂殖壺菌細胞破壁.不同的細胞破碎方法直接影響DHA的產量、質量和生產成本，因此選取一種合適的細胞破壁工藝對工業化生產DHA尤為重要[9-10].目前在DHA的實際生產中，主要采用高壓勻質等技術進行細胞破壁以釋放胞內油脂，但高壓勻質單次破壁效果差，須進行多次重復操作，易造成勻質機損耗嚴重，影響大規模連續作業[11].

本研究選取多種不同的細胞破壁方法，通過對比總油脂產量并權衡實際工業生產的可操作性，確定裂殖壺菌的最適破壁方法，優化破壁工藝條件，以期為DHA的工業化生產提供一定的技術支持.

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

裂殖壺菌菌株FJU-512由本課題組保存，菌粉來源：15 L發酵罐發酵后收取菌液，6 000 r/min離心取菌體沉淀，-80 ℃凍干菌體即得菌粉.

1.1.2試劑

氫氧化鈉、碳酸鈉、鹽酸、乙醇、正己烷：國藥集團化學試劑有限公司，分析純；堿性蛋白酶(比酶活≥200 U/mg)、中性蛋白酶(比酶活≥100 U/mg)、纖維素酶(比酶活≥30 U/mg)、β-葡聚糖酶(比酶活≥3 000 U/mg)：Ruibio公司.

1.1.3儀器

高壓滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；雙層全控溫搖床：上海智誠分析儀器有限公司；高速臺式冷凍離心機：Beckman Coulter公司；紫外分光光度計：Amersham Bioscience公司；循環水多用真空泵：鄭州長城工貿有限公司；恒溫培養箱：上海智誠分析儀器有限公司；超級恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；凍干機：Labconco公司，FreeZone系列.

1.2方法

1.2.1細胞破壁

1) 酸熱法：取1 g裂殖壺菌菌粉于10 mL離心管，加入3 mL 30%(質量分數)的濃鹽酸，重懸菌體，80 ℃恒溫水浴1.0 h.

2) 堿熱法：取1 g裂殖壺菌菌粉于10 mL離心管，加入3 mL pH 10.0的復合堿液(n(氫氧化鈉)∶n(碳酸鈉)=10∶1)，80 ℃恒溫水浴2.0 h.

3) 超聲波法：取1 g裂殖壺菌菌粉于10 mL離心管，加入3 mL單蒸水重懸菌體，置于400 Hz下超聲4 s，間隔4 s，持續1.0 h.

4) 酶法：取1 g裂殖壺菌菌粉于10 mL離心管，加入3 mL pH已調為10.0的單蒸水重懸菌體，酶用量2.0%(占菌體干質量的百分比，下同)，50 ℃恒溫水浴酶解2.0 h.

1.2.2油脂提取

破壁待冷卻后加0.75 mL無水乙醇與2 mL正己烷，充分搖勻，1 200 r/min離心2 min，萃取油脂，取上清于已知質量的螺口管中.重復3次，充分萃取油脂.將螺口瓶置于干燥器中真空過夜抽干即得油脂，再次稱得的質量減去螺口管質量即為油脂質量.

2結果與分析

2.1不同破壁方法對油脂提取的影響

以裂殖壺菌菌株FJU-512菌粉為材料，采用4種不同的細胞破壁方法(酸熱法、堿熱法、超聲波法、酶法)對其進行破壁，各種破壁方法獲得的總油脂及DHA產量如圖1所示.其中酶法和堿熱法效果最好，每克菌體細胞總油脂產量分別達到0.453 5和0.446 6 g，其次為酸熱法0.426 9 g，而超聲波法破壁效果相對較差，僅0.399 6 g.酶法作用條件溫和、高效、低能耗，且能確保內含物成分破壞最小；另外，目前工業酶價格低廉且易得，因此確定裂殖壺菌最佳破壁方法為酶法.

圖1　不同的細胞破壁方法獲得的總油脂及DHA產量Fig.1Effects of different cell disruption methods on total lipid and DHA yields

2.2不同種類酶對油脂提取的影響

選用堿性蛋白酶、纖維素酶、中性蛋白酶和β-葡聚糖酶作為破壁試驗用酶，分別考察不同酶對裂殖壺菌細胞破壁的效果，各酶用量均為2.0%，且均依據各自產品說明書的條件下酶解2.0 h.不同種類酶處理獲取的總油脂量見圖2.

圖2　不同種類酶處理獲取的總油脂產量Fig.2Effects of different enzymes on total lipid yields

如圖2所示，堿性蛋白酶破壁效果最好，用其破壁所得的總油脂產量最高，其他幾種酶的破壁效果依次為中性蛋白酶>纖維素酶>β-葡聚糖酶.堿性蛋白酶的作用位點在羧基側富含芳香氨基酸(如酪氨酸和苯丙氨酸)或者疏水性氨基酸(如丙氨酸和亮氨酸)構成的肽鍵[12-13]，所以比中性蛋白酶和酸性蛋白酶的水解能力更強；同時還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉酯化甚至轉肽的功能.堿性蛋白酶的這些特性使其可以將復雜的大分子蛋白質結構降解成低分子質量的小分子肽鏈或者氨基酸；其另一種功能可能與部分破壞蛋白質結構有關，可使蛋白質組分變得易于吸收或洗去.目前工業上應用最廣的也是堿性蛋白酶，因此本研究選取堿性蛋白酶作為試驗用酶.

2.3堿性蛋白酶酶解條件的單因素試驗

2.3.1酶解溫度的影響

酶的化學成分為蛋白質，溫度對其生物催化活性至關重要，根據堿性蛋白酶的性質，選取45～65 ℃溫度區間考察.稱取1 g裂殖壺菌菌粉于10 mL離心管，加入3 mL pH已調為10.0的單蒸水重懸菌體，酶用量2.0%，恒溫水浴酶解2.0 h，考察不同酶解溫度對總油脂產量的影響，結果如圖3所示.

圖3　酶解溫度對總油脂產量的影響Fig.3Effect of enzymatic temperature on total lipid yield

由圖3可知：隨著溫度的升高，裂殖壺菌總油脂產量先升后降，在55 ℃時總油脂產量最高，則可知在此溫度下，酶的催化活性最高，細胞破壁效果最好；而當溫度超過55 ℃時總油脂產量下降，可能是因為溫度過高部分酶已經開始失活.因此選取正交試驗的溫度范圍為50～60 ℃.

2.3.2酶解pH的影響

除溫度外，pH條件對酶的催化效果也有較大影響，pH的偏移會導致酶活性部位結構的改變而影響其活性.根據堿性蛋白酶的最適pH范圍，選取pH 8.5～10.5區間考察其對總油脂產量的影響，酶解溫度為55 ℃，裂殖壺菌菌粉量、酶解時間以及酶用量同上，結果如圖4所示.

圖4　酶解pH對總油脂產量的影響Fig.4Effect of enzymatic pH on total lipid yield

由圖4可知：裂殖壺菌總油脂產量隨著pH升高先增加后降低，在pH為9.5時達到最高，可知該酶的最適pH為9.5，pH偏高或偏低都不易使酶發揮好的催化效果.因此選取正交試驗的pH范圍為9.0～10.0.

2.3.3酶解時間的影響

一般酶解時間越長，細胞破壁效果越好，總油脂產量也會越高.但酶解反應時間過長會導致胞內其他共溶物質逐步滲出，從而增加后期DHA分離的難度；同時過長的時間在實際生產中也需要相應增加能耗成本.因此選取1.5～3.5 h時間區域進行考察，酶解溫度為55 ℃，酶解pH為9.5，裂殖壺菌菌粉量和酶用量同上，結果如圖5所示.

圖5　酶解時間對總油脂產量的影響Fig.5Effect of enzymatic time on total lipid yield

由圖5可知：堿性蛋白酶在最佳酶解溫度和pH條件下，總油脂產量得到一定的提高且相對穩定，在酶解2.0和3.5 h后達到2個高峰，基于后期DHA分離難度和能耗成本考慮，選取正交試驗的酶解時間范圍為1.5～2.5 h.

2.3.4酶用量的影響

酶用量的多少與底物的濃度存在一定的聯系，偏少時細胞破壁不徹底，偏多又可能造成產物抑制而影響酶的活性，因此選擇適宜的酶用量尤為重要.在酶用量為1.0%～3.0%，溫度為55 ℃，pH為9.5的條件下酶解2.0 h，考察不同酶用量對總油脂產量的影響，結果如圖6所示.

圖6　酶用量對總油脂提取量的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on total lipid yield

由圖6可知：隨著酶用量的增加，總油脂產量逐漸增加，在2.0%的酶用量下達到最高，隨后酶用量再增加，總油脂產量則逐漸減少.由此可知，在破碎裂殖壺菌細胞時，堿性蛋白酶的最佳酶用量為2.0%，此時底物與酶能最有效地結合，破壁效果最好，因此選取正交試驗的酶用量范圍為1.5%～2.5%.

2.4堿性蛋白酶酶解條件的正交試驗

以堿性蛋白酶為試驗用酶，總油脂產量為試驗指標，設計4因素3水平 L9(34)正交試驗(表1)，對酶解溫度、pH、時間及酶用量進行優化，以確定最佳酶解條件，結果見表2，方差分析結果見表3.

表1　正交試驗因素水平表Tab.1　Factors and levels of the orthogonal test

由表3可知，因素A(溫度)、因素B(pH)、因素C(時間)、因素D(酶用量)對結果影響的顯著程度依次為B>A>D>C，綜合各個因素的k值可得，正交試驗理論最優酶解條件為A2B3C2D2，即溫度55 ℃，pH 10.0，酶解時間2.0 h，酶用量為2.0%.

2.5堿性蛋白酶酶解條件的重復驗證實驗

為了驗證正交試驗的準確性和有效性，將正交試驗獲得的最佳酶解條件進行重復實驗，通過3組平行實驗(總油脂產量分別為0.459 1，0.458 5和0.458 3 g)得出裂殖壺菌菌株FJU-512平均總油脂產量為0.458 6 g.使用優化的酶解破壁方法，總油脂產量分別比酸熱法高7.42%，比堿熱法高2.69%，比超聲波法高14.76%.

表2　正交試驗結果Tab.2　Result of the orthogonal test

注：k表示各水平的總和，R表示極差.

表3　方差分析結果Tab.3　Variance analysis of the orthogonal test

注：r2=0.926 99.

3討論與結論

裂殖壺菌細胞破壁的方法多樣，具有各自的特點和優點，且其工藝也日趨成熟，但仍然存在諸如能耗高、耗時長、反應條件劇烈造成部分DHA氧化等問題.為優化破碎工藝，本研究以裂殖壺菌菌株FJU-512為材料，首先對4種細胞破壁方法提取油脂的效果進行了比較，發現其中酶法和堿熱法提取的油脂產量均較高且操作簡單，而酸熱法和超聲波法提取的油脂產量略低.就工業化而言，超聲法對設備要求較高，而堿熱法和酸熱法若大規模應用則更為耗能.綜合上述條件，選用酶法作為裂殖壺菌破壁的方法.

進一步對酶法破壁工藝進行優化.通過比較確定最佳用酶為堿性蛋白酶，進而設計4因素3水平L9(34)正交試驗，確定堿性蛋白酶酶解的最適條件為溫度55 ℃，pH 10.0，酶解時間2.0 h，酶用量2.0%.通過重復驗證得到裂殖壺菌菌株FJU-512的每克菌體細胞總油脂產量為0.458 6 g，證實了最佳酶解條件的優越性.

隨著工業化設備的配套和生產工藝的發展，酶法作為一種高效、經濟的油脂提取方法將為油脂的工業生產打開一個新局面，本研究也為后續有針對性地分離純化DHA的工藝奠定了基礎.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201511012

收稿日期：2015-11-10錄用日期：2016-02-23

基金項目：福建省自然科學基金重大項目(2011H6007)；福建省自然科學基金(2009J05057)；福建省科技重大專項(2010NZ0001-4)；福建省發改委產業化專項(閩財指[2010]358號)；福建省科技創新平臺項目(2014Y2008)

*通信作者：hwsql@126.com

中圖分類號:TQ 920.6

文獻標志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)04-0606-05

Lipid Extraction of Schizochytrium sp. FJU-512 by Different Wall-breaking Processes

HE Wensheng1,2*,WANG Can2，YANG Shiying2

(1.Fujian Vocational College of Bio-engineering,Fuzhou 350002,China;2.National and Local Joint Engineering Research Center of Industrial Microbial Fermentation Technology,School of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350117,China)

Abstract:As one of the high-yield strains for DHA,Schizochytrium is currently used in commercial production of DHA.Therefore,cell disruption is an important process in the industrialized extraction for DHA.In this study,the effects of different cell disruption methods,such as acid-heating extraction,base-heating extraction,ultrasonic extraction and enzymatic extraction,on the extraction of single cell lipid of Schizochytrium sp.FJU-512 were demonstrated.Results indicated that enzymatic extraction was more effective than other three methods.Furthermore,the influence of different kinds of enzymes on lipid extraction was examined.It was found that the alkaline protease was the most effective enzyme according to the result of cell crushing.To further improve the yield of total lipid extraction,orthogonal test was applied to optimize the enzymatic hydrolysis conditions.The optimal condition was as follows:enzyme dosage of 2.0% cell mass,incubation at 55 ℃,pH 10.0 for 2.0 h,under which the highest total lipid yield could be achieved,up to 0.458 6 g per gram cells.

Key words:Schizochytrium;extraction;lipid;enzymatic disruption

引文格式：何文勝，王燦，楊詩穎.裂殖壺菌菌株FJU-512油脂提取的細胞破壁工藝[J].廈門大學學報(自然科學版)，2016,55(4)：606-610.

Citation：HE W S, WANG C，YANG S Y．Lipid extraction ofSchizochytriumsp. FJU-512 by different wall-breaking processes[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：606-610．(in Chinese)