GPC3在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相關性肝癌組織中的表達及其意義

楊文麗　申旺　廖悅華　孫麗霞　余衛東　劉瓊茹

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GPC3在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相關性肝癌組織中的表達及其意義

楊文麗申旺廖悅華孫麗霞余衛東劉瓊茹

529030 江門，中山大學附屬江門中心醫院病理科(楊文麗，廖悅華，孫麗霞，余衛東，劉瓊茹)；529000 江門，江門市五邑中醫院檢驗科 (申旺)

【摘要】目的探討磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在HBV和丙型肝炎病毒(HCV)相關性肝癌中的表達及其意義。 方法收集肝癌肝組織及相應的癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm的肝組織)47對(HBV相關性肝癌31例、HCV相關性肝癌16例)、肝硬化肝組織36例(HBV相關性肝硬化22例、HCV相關性肝硬化14例)、慢性肝炎肝組織26例(乙型病毒性肝炎18例、丙型病毒性肝炎8例)、正常肝組織12例，采用免疫組織化學法檢測GPC3在上述肝組織的表達水平，并比較其陽性率。 結果GPC3在正常肝組織、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎肝組織中均無表達；GPC3在HCV相關性肝癌、癌旁組織、肝硬化組織中的陽性率分別為100%、37.5%、28.6%，均明顯高于HBV相關性肝癌、癌旁組織、肝硬化組織(分別為74.2%、9.7%、0%，P均<0.05)，但與合并肝硬化的HBV相關性肝癌(91.3%)及其癌旁組織(13.0%)比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 GPC3在HBV和HCV相關性肝癌中均呈高度表達，在HCV相關性肝癌中更為顯著，其可能在肝炎-肝硬化-肝癌的進程中發揮重要的作用。

【關鍵詞】磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；乙型肝炎病毒；丙型肝炎病毒；免疫組織化學

肝癌是常見的惡性腫瘤之一。全世界每年大約43.7萬人被診斷為肝癌，其中約50%的肝癌發生在中國[1-2]。流行病學和實驗室研究表明，肝癌的主要病因有HBV、丙型肝炎病毒(HCV)感染和黃曲霉素B1(AFB1)的攝入以及酗酒，而在我國HBV和HCV慢性感染是導致肝癌發生的最主要因素[3]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在胎兒肝臟中表達豐富，在成人肝臟中不表達，肝癌發生時被激活，通過整合素、胰島素樣生長因子和Wnt信號通路等途徑促進肝癌細胞的生長[4]。本研究著重于從“肝炎-肝硬化-肝癌”逐步進展的角度，對正常肝組織和HBV或HCV感染引起的肝炎、肝硬化、肝癌組織及癌旁肝組織的GPC3進行免疫組織化學(IHC)分析，探討GPC3在HBV相關性肝癌和HCV相關性肝癌發生、發展中的作用及其區別。

對象與方法

一、研究對象

收集2012年8月至2015年4月在中山大學附屬江門中心醫院行外科手術切除并經病理學確診且有完整臨床資料的肝癌肝組織及相應的癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm的肝組織)47對，患者男40例、女7例，年齡37～72歲、中位年齡56歲。其中HBV相關性肝癌患者31例(同時合并有肝硬化23例)，HCV相關性肝癌患者16例。收集同期肝硬化手術切除或接受病理活組織檢查(活檢)的肝組織36例，患者男31例，女5例，年齡32～58歲、中位年齡48歲，其中HBV相關性肝硬化患者22例、HCV相關性肝硬化患者14例。收集同期穿刺的肝炎肝組織26例，患者男21例、女5例，年齡35～61歲、中位年齡50歲，其中慢性乙型肝炎(乙肝)患者18例、慢性丙型肝炎(丙肝)患者8例。同時收集12例正常肝組織(均取自外科手術切除的肝血管瘤旁組織)，患者男10例、女2例，年齡31～59歲、中位年齡43歲。該研究經本院醫學倫理委員會批準，入組患者均簽署病理檢查知情同意書。

二、方法

采用IHC染色法檢測GPC3的表達。標本經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm連續切片后，放于陽離子玻片上，于烤箱中65℃ 2 h使石蠟熔化，再用Roche-Ventana公司的BenchMark XT 全自動IHC染色機染色。GPC3一抗為鼠抗人單克隆抗體，克隆號1G12，稀釋度1∶200，一抗及抗體稀釋液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Ultra ViewTM通用二氨聯苯胺檢測試劑盒和所配套試劑均購自上海羅氏診斷產品有限公司，所用程序為S3732。

三、結果判斷

由2位資深病理科醫師采用雙盲法對染色結果進行評估。以細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性，綜合組織染色強度和陽性細胞數進行半定量法評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比評分標準：陰性為0分，陽性細胞比例少于10%記1分，陽性細胞比例10%～50%記2分，陽性細胞比例51%～80%記3分，陽性細胞比例81%～100%記4分。總染色評分=染色強度評分×染色細胞百分比評分。0～1分為陰性，2～4分為低表達，5～8分為中表達，9～12分為高表達[5]。

四、統計學處理

使用SPSS 19.0統計學軟件處理數據。計數資料以百分比表示，同一部位組織間比較采用配對四格表資料χ2檢驗，不同部位組織間比較采用成組設計四格表資料χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，多組間兩兩比較用Bonferroni法校正。

結果

一、各組肝組織GPC3的表達情況分析

正常肝組織組、乙肝組、丙肝組和HBV感染肝硬化組肝組織均未見GPC3的表達；HBV和HCV感染肝癌組的GPC3陽性率與癌旁組織及其相應的肝炎組、肝硬化組肝組織比較差異均有統計學意義(P<0.001，小于校正后的檢驗水平0.05/4=0.012)；HBV和HCV感染的癌旁組織GPC3表達的陽性率均高于相應的肝硬化組肝組織，但比較差異均無統計學意義(P值分別為0.013、0.604，P均>0.005)；GPC3在HCV相關性肝癌、癌旁組織、肝硬化組織中的陽性率均明顯高于HBV相關性肝癌、癌旁組織、肝硬化組織(P均<0.05)，見圖1及表1。

二、合并肝硬化的HBV相關性肝癌及癌旁組織的GPC3表達分析。

根據HBV或HCV相關性及肝癌是否合并肝硬化的情況，將肝癌和癌旁組織分為3組：HCV相關性組、HBV相關性合并肝硬化組、HBV相關性未合并肝硬化組。對3組中的肝癌、癌旁組織的GPC3陽性率進行比較，發現HCV相關性肝癌組和HBV相關性合并肝硬化組肝癌的GPC3陽性率高于無合并有肝硬化的HBV相關性肝癌(P<0.001，小于校正后的檢驗水平0.05/3=0.017)，而與癌旁組織的GPC3陽性率比較差異并無統計學意義(P>0.017)。見表2。

表1　GPC3在正常肝組織、HBV及HCV感染肝組織中的表達情況

注：aHCV感染的肝硬化組、肝癌組和癌旁組織組與HBV相對應組GPC3陽性率的兩兩比較；bHBV感染的肝癌組與HBV感染的其他組及正常組織組GPC3陽性率的比較，P均<0.012；cHCV感染的肝癌組與HCV感染的其他組及正常組織組GPC3陽性率的比較，P<0.012

圖1　GPC3在正常肝組織、HBV及HCV感染肝組織中的表達(IHC染色，A、B、D×40，C、E×200)

A：HBV感染肝硬化組織，GPC3陰性；B：HBV相關性肝癌組織，GPC3陰性；C：合并肝硬化的HBV相關性肝癌組織，GPC3陽性；D：HCV感染肝硬化組織，GPC3陽性；E：HCV相關性肝癌，GPC3陽性

討論

GPC3為硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)家族成員，其核心結構包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(HS)鏈和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)，并通過GPI錨定在細胞膜表面[6]。GPC3在胚胎及胎兒期組織器官的形成和發育階段扮演著重要角色，主要作用是防止組織器官生長過大并在整體上調節身體大小。從出生后到成人階段，GPC3除在胎盤、乳腺、間皮、卵巢、肺及腎組織有弱表達外，在其他正常組織無明顯表達[7]。研究表明，GPC3高表達是肝癌形成過程中的早期事件，影響多種信號傳導途徑，經多聚陰離子GAG側鏈或核心蛋白與Win、胰島素樣生長因子-Ⅱ和轉化酶等共同作用，參與肝癌的發生、發展過程，并與肝細胞惡性轉化關系密切[8]。

表2　合并肝硬化的HBV相關性肝癌及癌旁組織的GPC3表達情況

注：aHCV相關性肝癌組與合并肝硬化、未合并有肝硬化的HBV相關性肝癌組比較；bHCV相關性癌旁組織組與合并肝硬化、無合并肝硬化的HBV相關性癌旁組織組比較；c合并肝硬化與無合并肝硬化的HBV相關性肝癌組、癌旁組織組比較

本研究中，正常肝組織、HBV感染的肝炎、肝硬化組織及癌旁肝組織中GPC3均陰性表達或低表達，而在HBV相關性肝癌中有較高的陽性率(74.2%)，與卞銀珠等[9]研究基本一致。研究也發現，GPC3在HCV感染的肝癌中陽性率為100%，遠大于其在癌旁組織和肝硬化中的表達率，與Abdul-Al等[10]研究相符，表明GPC3在HBV和HCV相關性肝癌的診斷中都具有很高的敏感度和特異度。

本研究發現，GPC3在HCV感染的肝硬化、肝癌及癌旁組織中的陽性率均高于HBV感染組的相對應組，這也許與GPC3在HBV和HCV中的致癌機制不同有關。HBV為DNA病毒，其主要通過基因整合到宿主染色體上，HBV通過與細胞表面GPC3的GAG側鏈相連進入人體細胞啟動了多級HBV侵入程序[11-12]。HCV為RNA病毒，在體內不與宿主染色體進行整合，HCV通過脂蛋白質脂肪酶與細胞表面的GPC3和其他HSPG結合，介導HCV與被膜靶細胞相互作用，并激活胰島素樣生長因子信號通道，從而使肝細胞發生惡變導致肝癌的發生[11,13]。由于HCV相關性肝癌均經歷了“肝炎-肝硬化-肝癌”的逐步發展過程，因此所有HCV感染的肝癌均同時合并有肝硬化，而一些HBV感染的肝炎可不經過肝硬化階段直接導致肝癌的發生，故本研究進一步對合并有肝硬化的HBV相關性肝癌及其癌旁組織進行分析。研究發現，HCV相關性肝癌和同時合并有肝硬化的HBV相關性肝癌GPC3的陽性率比較差異并無統計學意義，兩者與無合并肝硬化的HBV相關性肝癌中的GPC3陽性率比較差異均有統計學意義，這表明HCV和HBV相關性肝癌中的GPC3陽性率的差異與是否合并肝硬化有關，同時也提示GPC3在“肝炎-肝硬化-肝癌”的發展進程中發揮了重要的作用。

付順軍等[8]研究表明，肝癌及癌旁組織GPC3表達的強弱是影響肝癌患者術后無瘤生存率的獨立危險因素。殷欣等[11]研究認為HCV相關性肝癌患者總體生存率優于HBV相關性肝癌患者，這似乎與本研究中HCV相關性肝癌及其癌旁組織GPC3的表達率高于HBV相關性肝癌相矛盾。分析原因，可能與HBV相關性肝癌患者多在出現臨床癥狀下就診，導致病情發現晚，腫瘤大，伴血管癌栓，腫瘤突破包膜者比例高；而HCV相關性肝癌多發于老年患者，自然病程較長，腫瘤進展較緩慢有關。未對HBV相關性肝癌和HCV相關性肝癌患者的術后生存期分別進行統計分析，這是本研究的不足之處。

綜上所述，GPC3在HBV和HCV相關性肝癌組織中均高度表達，尤其是在其感染的“肝炎-肝硬化-肝癌”發展進程中發揮了重要的作用。

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(本文編輯：林燕薇)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.07.007

(收稿日期：2016-02-05)

Expression and significance of glyican-3 in hepatitis B virus- and hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma

YangWenli，ShenWang，LiaoYuehua，SunLixia，YuWeidong，LiuQiongru.

DepartmentofPathologyLaboratory，JiangmenCentralHospitalofSunYat-senUniversity，Jiangmen529030，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and significance of glyican-3 (GPC3) in the hepatitis B virus (HBV)- and hepatitis C virus (HCV)-related hepatocellular carcinoma. MethodsLiver cancer tissues and paired para-carcinoma tissues (approximately 2-cm from the cancer tissue margins) from 47 cases (31 with HBV-related hepatocellular carcinoma and 16 with HCV-related hepatocellular carcinoma), liver tissues from 36 with liver cirrhosis(22 with HBV and 14 with HCV), liver tissues from 26 with chronic hepatitis (18 with HBV and 8 with HCV) and normal liver tissues from 12 healthy subjects were collected. The expression levels and positive rates of GPC3 in different specimens were statistically compared by using immunohistochemical staining. ResultsGPC3 was not expressed in the normal liver tissues, and liver tissue from chronic hepatitis B and C. The positive rates of GPC3 in the HCV-related hepatocellular carcinoma, para-cancerous tissues, liver cirrhosis were 100.0%, 37.5% and 28.6%, significantly higher than 74.2% in HBV-related hepatocellular carcinoma, 9.7% in para-cancerous tissues and 0% in cirrhosis (all P<0.05), but did not significantly differ from 91.3% in the HBV-related hepatocellular carcinoma and 13.0% in paired para-cancerous tissues complicated with cirrhosis (both P>0.05). ConclusionsGPC3 is highly expressed in HBV- and HCV-related hepatocellular carcinoma, especially in HCV-related hepatocellular carcinoma, which probably plays a pivotal role during the progression from hepatitis, cirrhosis to hepatocellular carcinoma.

【Key words】Glypican-3; Hepatitis B virus; Hepatitis C virus; Immunohistochemical analysis