乙醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶偶聯催化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

劉麗勤，　張駿梁，　譚　俊，　陳代杰，　李亞軍，　邵　雷*

1. 上海師范大學生命與環境科學學院， 上海 200234； 2. 中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室， 上海 201203

?

乙醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶偶聯催化制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

劉麗勤1,2，張駿梁2，譚俊2，陳代杰2，李亞軍2，邵雷2*

1. 上海師范大學生命與環境科學學院， 上海 200234； 2. 中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室， 上海 201203

摘要：(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是抗癌藥物克唑替尼的手性合成前體，可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮經乙醇脫氫酶催化還原制備，還原中所需的還原型輔酶Ⅱ再生是該反應的技術瓶頸。本研究構建重組大腸桿菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH，實現了葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的共表達，并進行偶聯轉化。結果表明，當在反應溫度為30 ℃，pH為7的條件下，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的產量達到最高，在投料量為6%時，該體系轉化率為93.75%。

關鍵詞：輔酶再生； 乙醇脫氫酶； 葡萄糖脫氫酶； (S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

由氧化還原酶催化的酮基的手性還原是獲得含有羥基的手性化合物的重要方法[1]。其中苯乙酮相關化合物的手性還原產物是多種藥物的手性中間體。克唑替尼由輝瑞公司開發用于治療間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性的局部晚期和轉移的非小細胞肺癌(NSCLC)，于2011年獲得FDA批準上市[2-3]。克唑替尼的合成工藝中[4]，合成前體為(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，該前體可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮經乙醇脫氫酶(ADH)[5]手性催化還原制備。氧化還原酶廣泛用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等[6]，乙醇脫氫酶的催化反應需要還原型輔酶Ⅱ的參與[7]。還原型輔酶的價格昂貴，且很不穩定[8]，不可能作為大量制備(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的原料。在本文的工作中，我們使用葡萄糖脫氫酶(GDH)催化還原型輔酶Ⅱ的再生[9-10]，構建了雙酶偶聯體系，如圖1所示，可以低成本的催化2,6-二氯-3-氟苯乙酮還原為(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。

圖1　(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的酶法合成

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質粒

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET28a、pET21a均為本實驗室保藏。

1.1.2培養基

LB培養基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%氯化鈉。在此基礎上添加1.5%瓊脂粉為固體培養基。

1.1.3儀器與試劑

電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像儀(上海復日科技)；高效液相色譜儀(Agilent 1260)。限制性內切酶購自Thermo Fisher Scientific公司；質粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、蛋白質Marker、氨芐霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)均購自北京鼎國生物技術有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英國Oxoid公司)；2,6-二氯-3-氟苯乙酮購自上海邦成化工有限公司；(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇購自韶遠科技(上海)有限公司；其他試劑均購自國藥試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1GDH重組表達菌株的構建表達與測活

根據GDH基因序列(Genbank Number：J04805.1)委托英濰捷基生物公司合成基因序列片段。將GDH基因用核酸內切酶NdeⅠ和XhoⅠ從T載體上酶切回收，連入使用核酸內切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET28a載體，構建得到重組表達GDH的質粒pGDH-pET28a。

將pGDH-pET28a導入E.coliBL21(DE3)，得到GDH表達菌株E.coliBL21-GDH。挑取單菌落過夜培養后，以1∶100的比例接入含有100 μg/mL的卡那霉素的LB培養基中，37 ℃培養至OD600為0.6～0.8，加入終溶度為0.05 mmol/L IPTG。22 ℃誘導表達16 h。3 700 r/min，4 ℃離心收集菌體。將收集到的細胞重懸于緩沖液超聲破碎獲取目的蛋白，進行SDS-PAGE分析。

參考文獻方法[11]，以葡萄糖為底物測GDH的酶活，總反應體積為1 mL，反應液組成為：100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)中加入2.0 mmol/L NADP+和100 mmol/L葡萄糖。反應混合物于30 ℃保溫，加入一定量的GDH粗酶液后開始計時，每隔1 min檢測NADPH在340 nm吸光度的增加量。

1.2.2ADH與GDH共表達菌株的構建

根據ADH基因序列(Genbank Number：AY267012)委托英濰捷基生物公司合成基因序列片段。將ADH基因用核酸內切酶NdeⅠ和XhoⅠ從T載體上酶切回收，連入使用核酸內切酶NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET21a載體，構建得到重組表達ADH的質粒pADH-pET21a。

將pADH-pET21a和pGDH-pET28a共轉入E.coliBL21(DE3)，得到ADH與GDH共表達菌株E.coliBL21-ADH/GDH。將表達菌株E.coliBL21-ADH/GDH 接入LB培養基(含Amp和Kan各 100 μg/mL)中37 ℃培養。當OD600值達到0.6～0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.2 mmol/L，22 ℃誘導16 h，SDS-PAGE電泳檢測可溶性蛋白的表達。

1.2.3雙酶偶聯催化體系的構建與優化

將誘導表達的菌液在4 ℃，轉速為3 800 r/min 離心15 min，棄去上清液，收集菌體，用適量的0.1 mol/L 三乙醇胺緩沖液(pH=7.0)洗滌。最后用0.1 mol/L三乙醇胺緩沖液(pH=7.0)40 ml 重懸后超聲破碎。細胞破碎液在4 ℃，轉速為3 700 r/min條件下離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

在重組菌E.coliBL21-ADH/GDH粗酶液中(40 mL)，加入2.8 g葡萄糖，2.4 g 2,6-二氯-3-氟苯乙酮，置磁力攪拌器上，自動電位滴定儀調節pH穩定為7.0，30 ℃條件下反應一定時間，反應液加等體積乙酸乙酯萃取，離心取上清，分析底物及產物含量。摩爾產率=m產/m底× 100%；其中m底和m產分別代表底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮的初始濃度和反應后(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的濃度(mol)。采用外標法測定產物生成量，分別配制0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL 的標準溶液，254nm檢測紫外吸收。以溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，回歸方程：y=457.56x+71.542(R2=0.999 9)。

1.2.4轉化產物的分析

轉化液加乙酸乙酯萃取，12 000 r/min離心5 min，收集上層有機相，減壓濃縮后，上硅膠層析柱，用不同比例乙酸乙酯石油醚梯度洗脫，獲得少許純樣品。樣品用質譜和HPLC分析。HPLC檢測條件：色譜柱：Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長254 nm，流動相為甲醇：水(75∶25)流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃。產物對映體過量值(e.e.)的測定使用手性色譜柱，分析條件為：Welch Amy-DR column(4.6×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈：水(50∶50)，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm。e.e.值計算方式為：[A(s)-產物-A(R)-產物]/[A(s)-產物+A(R)-產物]×100%。A(s)-產物和A(R)-產物分別代表反應后(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的峰面積。

2結果與討論

2.1GDH的表達與測活

pGDH-pET28a用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為5.4 kb和0.8 kb的兩個片段，與預期結果相符，如圖2所示。

將收集的菌體超聲破碎，收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示，結果顯示誘導后的上清中含有重組質粒的表達產物約30 kD，而未經誘導的菌體破碎液則不含該條帶。

根據方法1.2.1，測得葡萄糖脫氫酶的酶活為81.2 U/ mL。一個酶活力單位(U)定義為在測定條件下，每分鐘產生1 μmol產物所需的酶量。

1: DNA Marker；2:NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切驗證質粒pGDH-pET28a；3:E.coliBL21-GDH未誘導破壁沉淀；4:E.coliBL21-GDH未誘導破壁上清液；5:E.coliBL21-GDH誘導后破壁沉淀；6:E.coliBL21-GDH誘導破壁上清液；7: 蛋白質Marker

圖2質粒pGDH-pET28a的雙酶切驗證和GDH 的SDS-PAGE

2.2雙質粒菌株的構建與共表達

pADH-pET21a用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約為5.4 kb和0.8 kb的兩個片段，與預期結果相符，如圖3所示。

共表達菌株的菌體經超聲破碎，收集上清與沉淀，進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示，在30 kD和29 kD位置有明顯的表達條帶，與GDH 和ADH 預期大小相符。

1:NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切驗證質粒pADH-pET21a；2: DNA Marker；3: 蛋白質Marker；4:E.coliBL21-ADH/GDH誘導后破壁上清液；5:E.coliBL21-ADH/GDH誘導后破壁沉淀; 6:E.coliBL21-ADH/GDH未誘導上清液；7:E.coliBL21-ADH/GDH未誘導沉淀

圖3質粒pADH-pET21a的雙酶切驗證和ADH與GDH共表達的SDS-PAGE

2.3雙酶偶聯催化生成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

按方法1.2.3配制40 mL反應體系，考察在其他條件相對穩定的情況下溫度對轉化率的影響，轉化分別在25 ℃、28 ℃、30 ℃、33 ℃ 和37 ℃條件進行下，轉化24 h后取樣檢測，以最高組產率為100%，比較其他組所得相對產率如圖4(A)所示，結果表明30 ℃為最適反應溫度。同時考察了在30 ℃條件下，pH對轉化率的影響，分別調節反應pH為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，轉化24 h后取樣檢測，所得相對產率如圖4(B)，結果表明pH 7.0為最適反應pH。

最佳轉化條件下的反應體系經過24 h的反應，轉化液(反應前后)取樣經過乙酸乙酯萃取后進行HPLC檢測，并與標準品對照(圖5)。結果表明，24 h反應終止時，底物轉化較為徹底，摩爾轉化率為93.75%。圖5D為反應產物經HPLC反相柱分析結果，2.4 min處為NADP(H)的吸收峰，5.4 min處為(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇產物。產物保留時間與標準品一致。

樣品經過分離純化后，使用質譜檢測其分子量。產物的質譜數據，ESI-MS(m/z)：210[M+H]+與(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的分子量一致。手性色譜柱分析表明產物的(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的e.e.值達到99%，催化酶對底物特異性較好，所轉化出的產物具有比較高的光學純度。

A：反應溫度對轉化率的影響

B：反應pH值對轉化率的影響

A：2,6-二氯-3-氟苯乙酮標品；B：(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇標品；C：初始轉化反應液；D：轉化24 h反應液

圖5(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇酶轉化體系的HPLC檢測

3結論

苯偶聯酮基側鏈的還原反應涉及到多種醫藥中間體的制備。使用共表達葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的粗酶液偶聯催化，手性還原2,6-二氯-3-氟苯乙酮，制備藥物中間體(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，在6%的投料濃度下，可以獲得轉化率90%以上的(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇產物，轉化體系簡單,易于后續的產物分離。使用葡萄糖脫氫酶循環再生還原型輔酶，有效降低了酶法還原的成本，表現出較好的應用前景。

[1]楊忠華, 王玉, 曾嶸等. 利用微生物重組技術促進羰基不對稱還原研究進展[J]. 生物加工過程, 2009, 7(6):8-14.

[2]Mologni L. Current and future treatment of anaplastic lymphoma kinase-rearranged cancer [J]. World J Clin Oncol , 2015, 6(5): 104-108.

[3]陳少波, 張厚德. 克唑替尼抗腫瘤的研究進展[J]. 中國現代醫生, 2015, (14):156-160.

[4]張廣艷, 李鵬程, 劉地發等. 克里唑替尼的合成工藝研究[J]. 中國藥物化學雜志, 2014(6):445-449.

[5]朱清禾, 賈紅華, 李艷等.Rhodococcuserythropolis手性醇脫氫酶的克隆表達及其性質[J]. 微生物學報, 2012，(1):83-89.

[6]Liu W, Wang P. Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis [J]. Biotechnol Adv , 2007, 25(4):369-384.

[7]諶容, 王秋巖, 殷曉浦等. 醇脫氫酶不對稱還原制備手性醇的研究進展[J]. 化工進展, 2011, 30(7):1562-1569.

[8]呂陳秋, 姜忠義, 王姣. 煙酰型輔酶NAD(P)+和NAD(P)H再生的研究進展[J]. 有機化學, 2004, 24(11):1366-1379.

[9]Xu Z, Jing K, Liu Y,etal. High-level expression of recombinant glucose dehydrogenase and its application in NADPH regeneration[J]. J Ind Microbiol Biotechnol , 2007, 34(1):83-90.

[10]唐江濤, 覃益民, 楊梅等. 葡萄糖脫氫酶高產工程菌的構建及融合蛋白的一步純化[J]. 工業微生物, 2008, 38(1):41-44.

[11]張錦芳, 籍小濤, 杜連祥. D-葡萄糖脫氫酶活力測定方法的研究——短小芽孢桿菌在D-核糖生產中的應用[J]. 天津科技大學學報, 2001,(3):37-40.

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.002

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81172962)，國家“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX9301002003)。

作者簡介：劉麗勤(1989～)，男，在讀碩士研究生，E-mail：xiansengliu@163.com。 *通訊作者: 邵雷，男，副研究員，E-mail：feihusl@163.com。

Preparation of (S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol catalyzed by coupling glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase

LIU Li-qin1,2,ZHANG Jun-liang2,TAN Jun2,CHEN Dai-jie2,LI Ya-jun2,SHAO Lei2

1. College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

Abstract(S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol is a chiral precursor of crizotinib, it can be prepared by catalytic reduction of 2,6-dichloro-3 fluoroacetophenone. CoenzymeⅡ regeneration is the technical bottleneck of the reaction. In this research，the recombinant E.coli BL21-ADH/GDH was constructed to realize the co expression of glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase. For the catalytic reaction, E.coli BL21-ADH/GDH could significantly transfer 2,6-Dichloro-3-fluoroacetophenone to (S)-1-(2,6-two chlorine-3-fluorine phenyl) ethanol under the conditions of 30 ℃, pH 7 and 6% feeding amount. The transform rate was 93.75%.

Key wordscoenzyme regeneration; alcohol dehydrogenase; glucose dehydrogenase; (S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol