常壓室溫等離子體誘變高通量篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產突變株

池亞斌，　顧　洋，　劉　龍, 2*，　李江華，　堵國成,2，　陳　堅,2

1. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室, 無錫 214122

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常壓室溫等離子體誘變高通量篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產突變株

池亞斌1，顧洋1，劉龍1, 2*，李江華1，堵國成1,2，陳堅1,2

1. 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；2. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室, 無錫 214122

摘要：采用新型常壓室溫等離子體(ARTP)誘變產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6，并應用顯色法和96孔板培養方法篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產突變株。研究表明顯色反應時添加四硼酸鉀溶液1 μL、PDABA 125 μL、反應時間5 min、反應溫度96 ℃時，N-乙酰氨基葡萄糖檢測的準確度最高。通過多輪ARTP誘變及高通量篩選最終獲得突變株(4A12)，3 L罐發酵GlcNAc產量達到36.14 g/L，較出發菌株(BSGN6)提高了65.32%。經過50次傳代后性狀穩定。ARTP誘變技術作為獲得產N-乙酰氨基葡萄糖高產菌株的有效途徑，與分子生物學手段相比，本方法更加快捷高效。

關鍵詞：離子體(ARTP)誘變； N-乙酰氨基葡萄糖； 高通量篩選

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作為氨基葡萄糖(GlcN)的衍生物，被廣泛應用于營養化學品和藥品行業中[1]。GlcNAc能夠提高內質網蛋白內穩態，因此能起到延長細胞壽命的作用[2]。研究表明，GlcNAc可以維持骨關節及軟骨組織的健康，對治療風濕性及類風濕性關節炎具有顯著功效[3]。此外，GlcNAc也可以有效的治療炎癥性腸病[4]。隨著人口老齡化的加劇以及GlcN和GlcNAc應用領域的延伸，其全球需求量將會繼續增加。微生物發酵法因綠色、環保、不受原材料限制等優點將成為N-乙酰氨基葡萄糖的首選生產方法[5]。本研究室在前期研究中通過代謝工程改造技術，獲得一株具有較高GlcNAc合成效率的枯草芽孢桿菌生產菌株BSGN6[2, 6, 7]。

常壓室溫等離子體(ARTP)生物誘變育種技術，因其具有射流溫度低(25 ℃～35 ℃)、對環境和人體無害、設備操作簡單等優勢，目前已被廣泛的應用于生物誘變育種領域[8]。研究表明，阿維鏈霉菌、發孢甲基變菌、酵母等微生物通過ARTP誘變，均能夠成功篩選得到高產突變株[8]。

然而目前，尚未有使用ARTP技術誘變結合高通量篩選方法誘變篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產突變菌的報道。本研究首次將ARTP誘變技術與96深孔板高通量篩選方法應用于篩選獲得產N-乙酰氨基葡萄糖誘變高產菌，建立并優化高通量篩選方法，并利用該方法成功篩選得到一株N-乙酰氨基葡萄糖產量高、氮源轉化效率高、葡萄糖轉化效率高的突變株(4A12)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

產N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6

1.1.2培養基

(1)斜面培養基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌121 ℃，15 min。

(2)種子培養基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌121 ℃，15 min。

(3)誘變篩選培養基 ① (g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖60(單獨滅菌)，木糖5(單獨滅菌)，15 mL微量元素溶液。

誘變篩選培養基 ②(g/L)：酵母粉2，蛋白胨1，硫酸銨1，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3(單獨滅菌)，葡萄糖60(單獨滅菌)，木糖5(單獨滅菌)，15 mL微量元素溶液。

(4)上罐發酵培養基(g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5, MgSO4·7H2O 3，葡萄糖30(單獨滅菌)，15 mL微量元素溶液。補料：葡萄糖800 g/L。115 ℃滅菌15 min。

(5)微量元素溶液(g/L)：CaCl24.0(單獨滅菌),MnSO4·5H2O 1.0, CoCl2·6H2O 0.4, NaMoO4·2H2O 0.2, ZnSO4·7H2O 0.2, AlCl3·6H2O 0.1, CuCl2·H2O 0.1, H3BO40.05。

1.1.3培養條件

(1)斜面培養

挑取甘油管保藏菌種劃線接種到斜面上進行活化，37 ℃恒溫培養12 h左右。

(2)96深孔板種子培養

用無菌牙簽將種子接至裝有100 μL種子培養基的96淺孔板中，置于96板搖床，600 r/min，37 ℃震蕩培養10 h。

(3)96深孔板發酵

取2 μL的種子接入裝有600 μL的96深孔板板，置于96板搖床，900 r/min，37 ℃震蕩培養48 h。

(4)搖瓶發酵種子培養

接一環經斜面活化的斜面種子到裝有25 mL種子培養基的500 mL三角瓶，8層紗布封口，置于旋轉式搖床上，220 r/min，37 ℃振蕩培養10 h。

(5)搖瓶發酵培養

5℅的接種量將種子培養基接入裝有95 mL發酵培養基的500 mL搖瓶，置于旋轉式搖床上，220 r/min，37 ℃振蕩培養48 h。

(6) 3 L發酵罐上補料發酵

以3%(v/v)接種量將活化好的種子液接至3 L發酵罐中，發酵罐裝液量為1.5 L，培養溫度為37 ℃。使用3 mol·L-1的鹽酸溶液及25%(v/v)的氨水調節pH，使其維持7.0。通氣量為1.5 vvm，初始攪拌轉速600 r/min 。當菌體達到一定濃度(OD600為0.4時)，添加木糖(終濃度5 g·L-1)進行誘導。發酵培養基含20 μg·mL-1的卡納霉素，葡萄糖初始溶度為20 g·L-1，采用反饋式葡萄糖流加(控制葡萄糖濃度在5 g·L-1)[9]。

1.2方法

1.2.1ARTP誘變操作

本研究使用ARTP對產GlcNAc基因工程菌BSGN6進行誘變處理，以高純氦氣作為工作氣體。在電源功率100 W、氣流量10 L/min、等離子體發射源照射樣品距離2 mm對10 μL菌液(106～107)CFU個/mL進行處理,分別考察了5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s和60 s時細胞的致死率[8][10]。

致死率計算公式：

注：其中U為不經過誘變處理對照菌的總菌數；T為誘變處理后的總菌數。

1.2.2高通量篩選方法的建立

為了快速高效篩選到GlcNAc高產菌株，本研究建立了比色法高通量檢測GlcNAc以及利用96深孔板高通量篩選的方法。高通量篩選方法流程如圖1所示。首先將誘變后涂布平板上長出的菌落接種于96潛孔板中作為種子液，37 ℃培養10 h后，取2 μL轉接至96深孔板誘變篩選培養基中，發酵培養48 h。發酵結束后，離心取2 μL上清液于96 PCR板中，加入43 μL超純水以及1 μL四硼酸鉀溶液(1.5 g四硼酸鉀溶解于25 mL超純水)后于96 ℃金屬浴加熱5 min，結束反應。取10 μL反應液于96淺孔板，向其中添加125 μL PDABA溶液(1 g對二甲基苯甲醛溶解于100 mL含1.25%鹽酸的冰醋酸中)，于37 ℃ 96板搖床反應10 min，利用酶標儀測定A585處吸光值，吸光值與GlcNAc的含量成正相關。根據酶標儀測定的數據，在96淺板中找出最高產量對應的突變株，并將其作為下一輪出發菌株進行誘變處理。經過多輪誘變后，將最終初篩獲得的高產菌株進行搖瓶驗證。

圖1　高通量篩選方法流程圖

1.2.3GlcNAc的檢測方法

GlcNAc的檢測采用高效液相色譜法(HPLC)，檢測條件如表1。

表1　HPLC法測定GlcNAc糖相關條件

2結果與討論

2.1高通量篩選方法的建立

綜合國內外報道，常用檢測GlcNAc的方法有苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法、DNS法、改進的Schales、Elson-Morgan、Reissig等。這些方法已經有研究者對其進行了深入的研究，研究發現Reissig方法具有靈敏度高，重復性好、穩定性好的特點[11]。因此在本研究中采用Reissig方法用來檢測GlcNAc。然而在本實驗中發現將Reissig方法終反應體系縮小至150 μL時，檢測0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標樣線性關系較差，R2只有0.8。因此本研究需要對該方法進行優化，使其能夠在較小的應體系也能保證較高的準確性。

將0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標樣線性關系R2值作為考察因素分別優化四硼酸鉀添加量、PDABA添加量、反應時間及反應溫度對，之后設計正交試驗設計以確定最合適反應條件。

2.1.1四硼酸鉀添加量的確定

為了確定合適的四硼酸鉀添加量，本文首先單一考察了四硼酸鉀添加量對顯色反應的影響，向檢測0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc標樣反應體系中各添加了1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、9 μL、11 μL和13 μL的四硼酸鉀。測定的R2如圖所示，結果顯示當添加3 μL時線性關系最佳，R2達到0.9。

2.1.2PDABA添加量的確定

PDABA的添加量對顯色反應具有重要的影響，添加量不夠會導致顯色不充分。同時PDABA自身溶液呈黃色，添加過多也會影響吸光值的大小。本研究中考察了添加25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、150 μL和200 μL時對表樣線性關系的影響。如圖3所示，當PDABA添加量為125 μL時，線性關系最佳，R2達到0.91。

圖2　四硼酸鉀添加量對R2的影響

圖3　PDABA添加量對R2的影響

2.1.3反應時間的確定

不同的反應時間也會造成顯色的差異，反應時間過短，會造成顯色不充分，測出的數值偏低。本研究中分別考察了1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min對顯色反應的影響，如圖4所示，反應時間為3 min左右時，效果最佳，R2達到0.88。

2.1.4反應溫度的確定

Reissig方法中反應條件是沸水浴，為了方便操作，在本實驗中我們采用的是96 PCR板金屬浴。因此需要確定最佳反應溫度，我們研究了90 ℃、91 ℃、92 ℃、93 ℃、94 ℃、95 ℃、96 ℃、97 ℃、98 ℃、99 ℃和100 ℃對顯色反應的影響。結果顯示，反應溫度為96 ℃時效果較好。

圖4　反應時間對R2的影響

圖5　反應溫度對R2的影響

2.1.5正交試驗設計

四硼酸鉀添加量、PDABA添加量、反應時間及反應溫度4個因素，以R2為指標，選用L9(34)正交表進行正交試驗[12]，各水平因素見表2-1。設計9組試驗，各組試驗結果及方差分析表見表2-2及表2-3。由正交試驗結果可知，最佳組合為：四硼酸鉀添加量1 μL、PDABA添加量125 μL、反應時間3 min、反應溫度95 ℃，與單因素組合優化的產量相比相差不大。

表2-1　各因素水平表

2.2ARTP致死率曲線測定

根據1.3所述對產GlcNAc工程菌BSGN6的ARTP致死率進行測定，致死率曲線如圖6所示。

從圖6可以看出，當ARTP誘變處理時間為10 s時，致死率可以達到98%。有研究表明，將致死率控制在95%～99%之間，可有利于獲得正向突變菌株。因此在本研究中，我們將誘變處理時間設定為10 s。

表2-2　R2正交試驗結果

表2-3　試驗結果方差分析表

圖6　BSGN6的ARTP致死曲線

2.3高氮源轉化率突變株的篩選

為了篩選獲得氮源轉化效率提高的突變菌株，我們設計了誘變篩選培養基 ②。在該培養基中，碳源(葡萄糖)含量過剩，以保證氮源全部被消耗完。同時根據材料與方法1.4所述，經過多輪誘變處理，初篩共篩選出24株較對照菌提高的正向突變菌株。

隨后我們對這24株菌進行搖瓶驗證，搖瓶驗證也使用是誘變篩選培養基 ②。搖瓶發酵48 h后，將發酵液離心取上清液通過高效液相色譜法檢測GlcNAc含量。如圖7所示，突變菌(5H7)在相同的條件下GlcNAc產量最高達到了4.75 g/L，較對照菌株BSGN6(3.25 g/L)相比提高了46.15%。

圖7　菌株BSGN6與突變菌株搖瓶發酵GlcNAc產量對比

2.4高葡萄糖轉化率突變株的篩選

我們將之前獲得氮源轉化效率最高突變菌(5H7)進一步誘變，以期獲得葡萄糖轉化效率高的突變菌。在這里我們采用誘變篩選培養基①，該培養基中氮源含量豐富，以保證碳源(葡萄糖)消耗完全。采用與之前相同的誘變條件，經過多輪誘變，初篩最終獲得18株正向突變菌株。

搖瓶驗證結果如圖8所示，其中突變菌(4A12)的GlcNAc產量達到9.12 g/L,較出發菌株(5H7)7.6 g/L相比提高了20%，突變菌(4A12)的葡萄糖轉化效率達到0.169 g GlcNAc/g Glucose。

2.53L罐發酵考察突變菌(4A12)發酵特性

我們以出發菌株BSGN6作為對照菌，在相同條件下發酵培養72 h考察突變株4A12在3 L罐發酵中的培養特性。從圖中可知，突變菌(4A12)最高產量達到36.14 g/L，較出發菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。整個發酵過程來看，突變菌的生物量都要低于發菌株，突變菌株最大菌體量為21.56 g/L,僅為出發菌株(25.62 g/L)的84.2%。

圖8　菌株5H7與突變株搖瓶發酵GlcNAc產量對比

注：菌株BSGN6與突變株4A12在3 L罐中GlcNAc發酵結果

注：菌株BSGN6與突變株4A12在3 L罐中菌體生長情況

2.6突變菌遺傳穩定性研究

為了考察突變菌4A12的遺傳穩定性，我們先將突變菌在固體培養基平板活化，然后轉接至液體種子培養基進行培養，后轉接至發酵培養基進行搖瓶發酵。同時繼續傳代，整個過程一共傳代培養50次。突變菌生產GlcNAc能力的穩定性結果如圖10所示。

從圖中可以看出突變菌4A12具有良好的遺傳穩定性，搖瓶發酵GlcNAc的產量維持在9 g/L左右。

3結論

本研究首次將ARTP誘變技術應用于高通量篩選產GlcNAc突變菌，同時并建立并優化了高通量比色法檢測GlcNAc篩選方法，研究表明當添加四硼酸鉀溶液添1 μL、PDABA 125 μL、反應時間5 min、反應溫度96 ℃時，N-乙酰氨基葡萄糖檢測的準確度最高。

圖10　突變菌株4A12遺傳穩定性

同時本研究通過建立的篩選方法利用不同的篩選培養基成功篩選獲得一株GlcNAc產量高、氮源轉化效率高、葡萄糖轉化效率高的突變株(4A12)，搖瓶發酵GlcNAc產量達到9.12 g/L，葡萄糖轉化效率達到0.169 g GlcNAc/g Glucose。3 L罐發酵GlcNAc產量達到36.14 g/L，較出發菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。之后我們也考察了突變株遺傳穩定性，通過傳代實驗，GlcNAc搖瓶產量維持在9 g/L左右，表明經ARTP誘變獲得這株突變菌(4A12)遺傳穩定性較好。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.003

基金項目：“江蘇省產學研聯合創新資金-前瞻性聯合研究項目”(項目編號：BY2012054)。

作者簡介：池亞斌(1990～)，男，碩士生。E-mail：1041507916@qq.com。 *通訊作者: 劉龍教授。Tel：0510-85918312，E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn。

High-throughput screening of Bacillus subtilis for N-acetylglucosamine production by ARTP mutation technology

CHI Ya-bin1, GU Yang1, LIU Long1,2, LI Jiang-hua1, DU Guo-cheng1, 2, CHEN Jian1, 2

1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. Key Laboratory of Carbohydrate and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

AbstractA novel atmospheric and room temperature plasma (ARTP) mutagenesis system was used by combining with the high throughput screening of 96-well microplates and chromogenic reaction to obtain high-yielding mutants. The optimum conditions for chromogenic reaction were as follows: otassium tetraborate solution 1 μL, PDABA 125 μL, reaction time 5 min, temperature 96 ℃. Through several rounds of ARTP mutation and high-throughput screening, a mutant (4A12) was obtained. In 3 L fermentor, the maximum GlcNAc production reached 36.14 g/L, which improved 65.32% compared with that of the control strain BSGN6. The results of subculture test showed that the mutant strain had stable hereditary characteristics after 50 generations. ARTP mutagenesis technique as an effective way to obtain high-yielding GlcNAc strains was better than molecular biology methods.

Key wordsARTP; GlcNAc; high-throughput screening