Tregs及巨噬細胞在幽門螺桿菌相關的不同病變中浸潤差異研究

袁小剛， 黃艷娟， 章任兵， 胡紅松

深圳市龍崗區人民醫院 1. 消化內科； 2. 婦產科； 3. 病理科，廣東 深圳 518172

Tregs及巨噬細胞在幽門螺桿菌相關的不同病變中浸潤差異研究

袁小剛1， 黃艷娟2， 章任兵3， 胡紅松1

深圳市龍崗區人民醫院 1. 消化內科； 2. 婦產科； 3. 病理科，廣東 深圳 518172

目的 分析幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)陽性和陰性的慢性淺表性胃炎、胃潰瘍標本中 CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞 (Tregs)及巨噬細胞浸潤差異，探討Tregs及巨噬細胞在H.pylori致病中的作用。方法 168例慢性淺表性胃炎、胃潰瘍標本中，H.pylori陽性89例，H.pylori陰性79例，采用免疫組化(IHC)檢測病理標本中Tregs及巨噬細胞浸潤情況。結果H.pylori陽性組胃黏膜標本中Tregs及巨噬細胞浸潤程度顯著高于H.pylori陰性組(P<0.01)；在H.pylori陽性病變組中，慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組比較，Tregs浸潤程度差異無統計學意義(P>0.05)，而巨噬細胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組(P<0.01)；在H.pylori陰性病變患者中，Tregs及巨噬細胞浸潤兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論H.pylori感染后 Tregs及巨噬細胞浸潤數量均顯著增加，前者抑制黏膜局部免疫反應，后者增加局部黏膜損傷，兩者浸潤差異及比例失衡可能是導致H.pylori感染后產生不同病變結局的原因之一。

幽門螺桿菌；調節性T細胞；巨噬細胞；免疫反應

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染后，可刺激機體募集多種炎癥細胞聚集在胃黏膜層，從而產生一系列免疫反應，包括宿主固有免疫應答和獲得性H.pylori特異性T細胞及B細胞相關的免疫應答，這些免疫應答可能清除體內H.pylori，同時導致黏膜不同程度的炎癥及損傷。CD4+CD25+調節性T細胞(Tregs)可抑制病原微生物感染后機體產生的強烈免疫反應，從而減輕組織的免疫損傷，但同時也保護了病原微生物，造成病原微生物的慢性持續感染[1]。巨噬細胞具有吞噬、抗原遞呈及分泌細胞因子等多種生物學功能，在促進炎癥反應、清除病原微生物等多種生物學過程中扮演了重要角色。

H.pylori感染機體后，Tregs及巨噬細胞均會被募集至胃黏膜組織中，發揮免疫調節等作用[2]。然而，在H.pylori相關的不同胃黏膜病變中，這種募集是否存在差異以及Tregs和巨噬細胞浸潤差異是否可能成為H.pylori感染后致胃黏膜形成不同病變的原因之一？本研究以人體胃竇黏膜標本為研究對象，采用IHC法比較H.pylori相關的不同病變中胃黏膜Tregs及巨噬細胞浸潤差異，旨在探討Tregs及巨噬細胞在人H.pylori感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 168例胃竇黏膜標本均取自因上消化道癥狀就診的患者，通過內鏡及活檢病理診斷為慢性淺表性胃炎者80例，胃潰瘍者88例，患者行胃鏡檢查時，在幽門前2 cm胃竇小彎側活檢胃竇黏膜2塊置于中性甲醛中固定。H.pylori陽性組共納入89例，其中淺表性胃炎者42例，胃潰瘍者47例；H.pylori陰性組共納入79例，其中淺表性胃炎者38例，胃潰瘍者41例。試劑：濃縮型鼠抗人Foxp3單克隆抗體(ab22510，美國abcam公司)，工作濃度均為1∶300(體積比)；濃縮型鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體(ab22506，美國abcam公司)，工作濃度均為1∶500(體積比)；PV-9000第二代通用型二步法IHC染色試劑盒及濃縮型 DAB 試劑盒(614864A；3 ml)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori檢測：胃竇黏膜石蠟標本行4 μm厚連續切片, 行病理常規HE染色，采用改良Giemsa 染色方法檢測H.pylori。Giemsa染液配制： 2 g Giemsa染料，加入蒸餾水100 ml，過濾。染色主要步驟：(1) 石蠟切片常規脫蠟、水化；(2)蒸餾水洗3遍，滴染Giemsa染液，25 min后自來水稍洗，95%酒精分化3次，100%酒精分化2次，自然晾干、封片?；颊呶哥R檢查前行14C呼氣試驗檢查，以改良Giemsa染色，14C呼氣試驗兩項檢查均陽性者判斷為H.pylori陽性，兩項檢查均陰性者判斷為H.pylori陰性(見圖1)。

1.2.2 Treg及巨噬細胞檢測：均采用IHC二步法，主要步驟: (1) 石蠟切片常規脫蠟、水化；(2) 3%過氧化氫浸泡8 min，以阻斷內源性過氧化物酶；(3) 切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐熱修復抗原15 min；(4) 分別滴加新鮮配制的鼠抗人Foxp3單克隆抗體，工作濃度均為1∶300(體積比)；鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體，工作濃度均為1∶500(體積比)；4 ℃冰箱恒溫過夜；(5) 滴加聚合酶輔助劑(Polymer Helper)，37 ℃恒溫培養箱內孵育30 min；(6)滴加辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37 ℃恒溫孵育30 min；(7)DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、封片。對照：淋巴結組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

結果判斷：以細胞核染成棕黃色為陽性細胞，每張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野分別計數陽性細胞及所有炎癥細胞，Tregs及巨噬細胞浸潤比率=陽性細胞數/總炎癥細胞數，以該比率的平均值作為Tregs及巨噬細胞浸潤程度。

2 結果

2.1 Tregs及巨噬細胞在H.pylori陽性與陰性病變組中的浸潤情況 IHC研究結果顯示H.pylori陽性組胃黏膜Tregs及巨噬細胞浸潤程度顯著高于H.pylori陰性組[(8.9±0.9)%vs(2.4±0.3)%、(15.3±1.2)%vs(8.2±0.7)%]，差異具有統計學意義(P<0.01)。

2.2 Tregs及巨噬細胞在H.pylori陽性患者不同病變組中的浸潤情況 在H.pylori陽性病變患者中，Tregs在慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組中的浸潤程度差異無統計學意義[(9.0±0.5)%vs(8.7±0.4)%,P>0.05]，而巨噬細胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組，差異具有統計學意義[(18.2±1.3)%vs(11.3±0.9)%,P<0.01](見圖1)。

圖1 Tregs及巨噬細胞在不同病變中的浸潤情況及H.pyloriA：潰瘍組巨噬細胞(400×)；B：慢性淺表性胃炎組巨噬細胞(400×)；C：潰瘍組Tregs(400×)；D：改良Giemsa顯示H.pylori(400×)

Fig 1 Tregs and macrophages infiltrated in different lesions andH.pyloriA: macrophages infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); B: macrophages infiltrated in chronic superficial gastritis lesions (400×); C: Tregs infiltrated in gastric ulcer lesions (400×); D: modified Giemsa showedH.pylori(400×)

2.3 Tregs及巨噬細胞在H.pylori陰性患者不同病變組中的浸潤情況 在H.pylori陰性病變患者中，Tregs及巨噬細胞浸潤兩組比較差異無統計學意義[(2.5±0.2)%vs(2.2±0.2)%, (8.3±0.4)%vs(8.0±0.4)%,P>0.05](見圖1)。

3 討論

全球半數以上人群感染H.pylori[3]，我國普通人群H.pylori感染率在60%左右。已證實H.pylori是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃MALT淋巴瘤的主要病因，同時也是胃癌的Ⅰ類致癌原。然而，不同地域、同一地域不同個體，或同一個體不同時間或空間，H.pylori感染的結局不盡相同，有的是慢性胃炎或消化性潰瘍，有的可能直接發展為胃癌。目前多數學者[4]認為H.pylori感染后產生的不同結局是由H.pylori菌株、個體與環境3種因素相互作用所致。然而，其具體機制尚不清楚。

獲得性H.pylori特異性T細胞免疫應答分為Th1型和Th2型。Th1型免疫反應釋放大量細胞因子，如IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-1等作用于B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞，使其在胃黏膜局部增殖、分化、激活，產生特異性和非特異性免疫反應，過度Th1型免疫反應可造成胃黏膜組織炎性損傷，導致胃十二指腸潰瘍等[5-8]。而Th2型免疫反應具有免疫調節作用，可抑制Th1型免疫應答，減輕炎癥反應，促進損傷組織修復、潰瘍愈合。有研究[9]顯示H.pylori感染機體后，激活宿主抗原提呈細胞，募集大量中性粒細胞、單核細胞及巨噬細胞等炎癥細胞浸潤至胃黏膜層，誘導以Th1型免疫應答為主的特異性T細胞免疫反應，同時抑制Th2型免疫反應，減少B細胞分泌IgA，造成免疫系統不足以清除H.pylori，致H.pylori持續慢性感染。本研究發現H.pylori陽性的病變胃黏膜中Tregs及巨噬細胞浸潤數量均顯著多于H.pylori陰性者，提示H.pylori感染后，Tregs及巨噬細胞被募集至胃黏膜組織中，產生免疫應答。

巨噬細胞在不同的刺激因子作用或微環境下可極化成不同的表型，根據極化后細胞表面標志分子及其功能的不同，可將巨噬細胞分為M1和M2型。M1型巨噬細胞能高效遞呈抗原、分泌大量促炎細胞因子，是激活Th1細胞反應的效應細胞，具有抗病原微生物等作用。相反，M2型巨噬細胞以發揮Th2型免疫反應為主，可抑制Th1免疫反應，具有促進損傷組織修復等功能。有研究[10]發現H.pylori感染后, 巨噬細胞分泌的細胞因子如 IL-1β、IL-6及TNF-α顯著升高。這提示H.pylori感染后，胃黏膜層募集的巨噬細胞極化為M1型為主。智利一項以5～18歲未成年人為調查對象的研究[11]發現H.pylori陽性患者胃黏膜組織勻漿中促炎細胞因子IL-1β、IL-8及TNF-α顯著高于H.pylori陰性患者，潰瘍患者IL-1β和IL-8的濃度顯著高于非潰瘍患者。本研究發現在H.pylori陽性病變組中，巨噬細胞在胃潰瘍組中浸潤程度顯著高于慢性淺表性胃炎組，這提示在H.pylori相關性潰瘍患者中，胃黏膜內聚集的巨噬細胞以M1型為主，發生Th1型免疫應答占優勢，當Th1型免疫應答得不到有效的免疫調節時，過度的Th1型免疫反應可能造成黏膜損傷，從而形成潰瘍。因此，本研究結果提示胃黏膜內巨噬細胞浸潤差異在H.pylori感染后形成不同結局中發揮了重要的作用。

Tregs可通過細胞接觸或分泌抑制性細胞因子等方式抑制功能性T細胞，從而抑制Th1型免疫反應，增強Th2型免疫反應。研究顯示H.pylori感染后胃黏膜內Tregs顯著增加，Tregs 可調節H.pylori感染所產生的Th1型免疫反應，減輕組織損傷，但同時也導致H.pylori逃逸免疫清除[12-13]。本研究顯示H.pylori陽性胃竇黏膜中Treg浸潤顯著高于H.pylori陰性者，但在H.pylori陽性組中，Tregs浸潤程度在慢性淺表性胃炎組與胃潰瘍組間比較差異無統計學意義。研究結果提示在H.pylori感染后，Tregs可能與巨噬細胞相互作用，調節巨噬細胞免疫應答，避免Th1型免疫反應過度造成組織損傷，使得Th1/Th2免疫反應達到一種平衡狀態，黏膜損傷及修復平行進行，從而導致胃黏膜炎癥持續慢性存在，這就形成了H.pylori相關性慢性胃炎；當巨噬細胞浸潤密度顯著增高或相對增高時，Tregs不足以調節M1型巨噬細胞所產生的Th1型免疫反應時，Th1/Th2免疫應答就失衡，Th1型免疫反應占優勢，過度的Th1型免疫反應造成了胃黏膜組織炎性損傷，從而形成H.pylori相關性消化性潰瘍。

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(責任編輯：李 健)

Differences of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-related lesions

YUAN Xiaogang1, HUANG Yanjuan2, ZHANG Renbing3, HU Hongsong1

1. Department of Gastroenterology; 2. Department of Obstetrics and Gynecology; 3. Department of Pathology, Longgang District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518172, China

Objective To analyze the differences of Tregs and macrophages infiltrated in the tissue specimens ofH.pylori-positive andH.pylori-negative chronic superficial gastritis and gastric ulcer,and to investigate the role of Tregs and macrophages in the pathogenesis ofH.pyloriinfection. Methods A total of 168 biopsies of chronic superficial gastritis and gastric ulcer were recruited, included 89H.pylori-positive and 79H.pylori-negative patients. Immunohistochemistry(IHC) was used to semi-quantify the number of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa.Results The proportion of Tregs and macrophages infiltrated in gastric mucosa inH.pyloripositive group was significantly higher than that inH.pylorinegative group (P<0.01). In theH.pyloripositive group, there was no significant difference of Tregs infiltration between chronic superficial gastritis and gastric ulcer group (P>0.05), but the degree of macrophage infiltrated in the gastric ulcer group was significantly higher than that in chronic superficial gastritis group(P<0.01). In theH.pylorinegative group, there was no significant difference of Tregs and macrophages infiltration between two groups(P>0.05).Conclusion The number of Tregs and macrophages infiltrated inH.pylori-positive disease is significantly increased, the former suppresses the local mucosa immune response, while the latter increases local mucosal injury. The difference of Tregs and macrophage invasion or imbalance may be one of the causes of determining the different clinical outcomes.

Helicobacter pylori; Regulatory T cells; Macrophages; Immune response

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.03.012

深圳市龍崗區科技計劃項目(No.YS2013011, No.YLWS20150514112402687)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20150402164314694)第一作者簡介：袁小剛，碩士研究生，主治醫師，研究方向：幽門螺桿菌及消化性腫瘤的基礎與臨床研究。E-mail:xiaogangyuan@hotmail.com

R573

A

1006-5709(2016)03-0283-04

2015-05-23