高溫預處理對力竭運動后人血液白細胞HSP70mRNA及自由基代謝的影響

陳　婷，張治遠，張月娟

(西藏民族大學 體育學院，陜西 咸陽　712082)

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高溫預處理對力竭運動后人血液白細胞HSP70mRNA及自由基代謝的影響

陳婷，張治遠，張月娟

(西藏民族大學 體育學院，陜西 咸陽712082)

摘要：目的：探討一次及多次高溫預處理對遞增負荷至力竭運動后人血液白細胞 HSP70mRNA及自由基代謝的影響。方法：受試者隨機分為運動對照組(C)，一次高溫預處理組(P1)，多次高溫預處理組(P2)。P1組進行一次性高溫預處理1 h(桑拿，溫度46±1 ℃，濕度85%-90%，體重下降2%)。P2組每隔三天進行一次(共八次)高溫預處理。C組采用Bruce方案在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭。P1和P2組高溫預處理結束，在室溫下恢復24 h后，在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭。運動結束后記錄最大心率、最大運動通氣量、最大攝氧量、呼吸商等，同時記錄通氣閾時的通氣量、最大攝氧量利用率等。C組、P1組及P2組于運動前、運動后即刻、運動后1 h分別采肘靜脈血。采用RT-PCR法檢測受試者血液白細胞HSP70mRNA表達，用硫代巴比妥(TBA)法測定血清丙二醛(MDA)含量，用黃嘌呤氧化酶法測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用全血乳酸分析儀測定血乳酸值。結果：C組力竭運動后即刻，人血液白細胞HSP70mRNA表達和血清MDA含量較安靜時顯著增加(P<0.01，P<0.05)。C組運動后1 h，HSP70mRNA表達及MDA含量較運動后即刻顯著減少(均P<0.05)，而血清SOD活性較運動后即刻顯著下降(P<0.05)。P1組在安靜時、運動后即刻及運動后1 h，均較C組相同時間點的HSP70mRNA顯著升高(均P<0.05)。而P1組在運動后1 h較C組同時間點的SOD活性顯著升高(P<0.05)。P2組血液在運動后即刻和運動后1 h，均較C組相同時間點的HSP70mRNA表達及血清SOD活性顯著升高(均P<0.05)。而P2組在安靜、運動后即刻及運動后1 h較C組同時間點的MDA含量均顯著減少(均P<0.05)。P2組在安靜時、運動后即刻及運動后1 h，均較P1組相同時間點的HSP70mRNA顯著下降(均P<0.05)。P1組、P2組力竭運動中通氣閾時通氣量VE較C組均顯著增加(P<0.05)，且受試者血液白細胞HSP70mRNA表達與血清SOD/MDA比例呈顯著正相關(R=0.48，P<0.05)。結論：一次及多次高溫預處理可上調運動后人血液白細胞HSP70mRNA表達，抑制力竭運動所造成的氧化應激損傷。且多次高溫預處理后HSP70mRNA表達降低，可能是對高溫重復應激的適應性反應。

關鍵詞：高溫預處理；HSP70mRNA；氧自由基；抗氧化酶；遞增負荷運動；力竭

研究發現，在缺血神經元損傷[1]，心肌梗死及心臟[2]、肝臟[3]、脊髓缺血再灌注損傷[4]等疾病模型中，高溫預處理均可發揮保護作用。其有益作用與熱休克蛋白70(HSP70)表達上調呈正相關[3]。HSP70在正常細胞中水平較低，而環境和生理應激(包括熱、冷、缺血、缺氧、損傷、運動等)狀態下HSP70可顯著升高[5-6]。研究表明，小鼠骨骼肌HSP70過表達可保護肌肉免于萎縮及骨骼肌功能紊亂[7]，心臟HSP70過表達可抑制缺血再灌注心肌細胞凋亡水平[8]。而敲除HSP70后的腦損傷小鼠，細胞死亡水平增加，活性氧ROS誘導的p53基因表達上調，導致外傷性腦部損傷進一步惡化[9]。可見HSP70在提高細胞存活率、減輕細胞受損傷程度、維持機體內穩態中發揮著重要的保護作用。有文獻報道，一次力竭運動[10]和長期運動訓練[11]均可造成機體HSP70合成增加，且高溫預處理后24 h人白細胞中HSP70蛋白表達較安靜時顯著上調。但關于高溫預處理對力竭運動后人血液白細胞HSP70mRNA表達的影響未見報道，HSP70mRNA是否會對高溫重復應激產生適應亦未見報道。因此，本研究建立一次和多次兩種高溫預處理方式，采用一次遞增負荷至力竭運動方案，探討一次及多次高溫預處理對力竭運動后人血液白細胞HSP70mRNA 及自由基代謝的影響，旨在為高溫預處理方式防治運動損傷研究提供實驗依據。

1材料與方法

1.1 實驗受試者與分組

受試者為華南師范大學體育科學學院20名健康男性大學生。隨機分為2組：一次高溫預處理組(P1)、多次高溫預處理組(P2)，每組10人。另外運動對照組(C)與P2組受試者相同，以此做多次高溫干預的前后對照。受試者在實驗期間禁止飲酒，常規活動，禁止大強度運動。C組采用Bruce方法在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭，作為力竭運動對照組。P1組干預方式為一次性高溫預處理1 h，P2組高溫預處理時間為一個月，每隔三天一次(共八次)，P1和P2組室溫恢復24 h后采用Bruce方法在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭。

表1　受試者身體特征±SD)

1.2主要儀器和試劑

主要儀器為Quinton Q55活動跑臺、2900心肺功能測試儀、Polar遙測心率表、YSI-1500 SPORT全血乳酸分析儀、PTC 200 PCR儀、Apollo水平電泳儀、BIO凝膠成像系統、722分光光度計、TU-1901紫外分光光度計、廣州氣體廠液氮等。主要試劑包括全血總RNA快速提取試劑盒、通用RT-PCR試劑盒、通用PCR優化試劑盒、HSPcDNA的引物、DNA Marker、EB、瓊脂糖、南京建成SOD和MDA測試盒。

1.3高溫預處理實驗方案

高溫預處理方案在文獻[12-13]基礎上改良[12-13]。P1組受試者高溫預處理1 h(桑拿，溫度46±1℃，濕度85%—90%，體重下降2%)，受試者分兩組進行桑拿，實驗人員陪同，觀察和詢問受試者情況。于安靜、高溫預處理0.5 h、高溫預處理后即刻記錄直腸溫度。P2組受試者每間隔三天進行一次(共八次)高溫預處理，桑拿方式同P1組。

1.4受試者運動方案

C組采用Bruce方法在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭[14-15](Bruce運動方案見表2)。P1組高溫預處理1 h及P2組多次高溫預處理結束，均在室溫(溫度25±0.5 ℃，濕度60%—65%)恢復24 h后，在跑臺上進行遞增負荷運動至力竭。運動方式同C組。

表2　Bruce運動方案

1.5最大攝氧量測定

采用Bruce運動方案，使用2 900氣體代謝儀進行測試，參照文獻[16]判斷VO2max：①吸氧量不再增加而出現平臺；②呼吸商大于1.1；③心率大于180/分；④血乳酸濃度在8 mmol/L以上。以上任何3種條件出現即可確定為最大攝氧量[16]。運動結束后記錄最大心率(HRmax)、最大運動通氣量(VEmax)、相對最大攝氧量(VO2max/kg)、最大攝氧量(VO2max)、呼吸商(R)、運動力竭時間(Time)。通氣閾參照通氣曲線進行判斷[17]，判斷方法為：①通氣量非線性上升的起點；②二氧化碳排出量非線性上升的起點；③二氧化碳當量非線性上升并不伴隨氧當量的變化。記錄通氣閾時各指標，包括心率(HR)、通氣量(VE)、最大攝氧量利用率(%VO2max)、呼吸商(R)、最大心率百分比(%HRmax)。

1.6受試者血液采集

C組、P1組及P2組于運動前安靜、遞增負荷運動后即刻、運動后1 h分別采肘靜脈血，測試受試者血液白細胞HSP70mRNA、血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、血乳酸。

1.7RT-PCR

取1 ml的EDTA-K2抗凝血，倒入DEPC處理的離心管，9 000轉離心2 min，去上清，加入1 ml的Trizol，4 ℃下12 000轉離心5 min。離心后加入氯仿0.2 mL，4 ℃下12 000轉離心15 min。加入異丙醇0.5 mL，4℃下12 000轉離心20 min，加入75%乙醇1 mL，4℃下10 000轉離心5 min。吸去剩余乙醇。取適量DEPC水溶解RNA。分裝出5 μl用于RNA定量，余下RNA用于反轉錄。利用紫外分光光度計測定所提取樣本總RNA濃度(μg/μl)。以A260/A280在1.8—2.0范圍作為RNA純度較好的標準。取4 μlRNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察18S和28S的完整性，檢測RNA有無降解。

反轉錄步驟：將提取的樣本RNA以2 μg/μl的濃度確定所需體積(<11 μl)，按照反轉錄試劑盒操作步驟加入Oligo(dT)1 μl，樣本RNA，加DEPC水至總體積12 μl，65 ℃孵育5 min。按反轉錄試劑盒操作步驟分別加入5×Reaction Buffer 4 μl、RiboLockTM Rnase Inhibitor (20 μ/μl) 1 μl、10mM dNTP Mix 2 μl、RevertAidTM M-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl) 1 μl，混合均勻后離心。42 ℃孵育60 min，70 ℃加熱5 min終止反應，獲得RT產物。

PCR步驟：按照試劑盒操作步驟，配成25 μl反應體系。分別加入2×Taq MasterMix 12.5 μl、Forward Primer(10 μM)1 μl、Reverse Primer(10 μM)1 μl、Template DNA<1 μg，加Rnase-free Water至總體積25 μl。充分混勻后離心，進行PCR反應(PCR引物見表3)。

PCR產物分析：取PCR產物各7.5 μl，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電壓80V，電泳60 min，之后采用Syngene凝膠成像系統成像并定量分析。以HSP70與β-actin擴增條帶的成像面積積分比值來評定HSP70mRNA表達水平。

表3　PCR引物

1.8血清MDA含量和SOD活性測定

采用硫代巴比妥(TBA)法測定血清丙二醛(MDA)含量，用黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，操作按照試劑盒說明書的規定程序進行。

1.9血乳酸值測試

用美國產YSI-1500 SPORT全血乳酸分析儀測定血乳酸值。

1.10數據采集與統計學處理

2實驗結果

2.1高溫預處理前中后受試者不同時刻直腸溫度的比較

P1組受試者直腸溫度在高溫預處理0.5 h、1 h均較高溫預處理前極顯著升高(P<0.01)，高溫預處理1 h較0.5 h極顯著升高(P<0.01)。P2組受試者進行8次高溫預處理，直腸溫度總平均值在高溫預處理0.5 h、1 h均較高溫前極顯著升高(P<0.01)。高溫預處理1 h較0.5 h極顯著升高(P<0.01)，見表4。

表4　高溫預處理前中后不同時刻受試者直腸溫度

注：*表示與高溫預處理前相比，P<0.05；**表示與高溫預處理前相比，P<0.01；#表示與高溫預處理0.5 h相比，P<0.05；##表示與高溫預處理0.5 h相比，P<0.01。

2.2高溫預處理前后受試者裸重的比較

P1組受試者高溫預處理后裸重極顯著下降(P<0.01)，下降百分比約為2%。P2組受試者進行8次高溫預處理后，裸重總平均值極顯著下降(P<0.01)，下降百分比約為2%。見表5。

表5　高溫預處理前后受試者裸重

注：**表示與高溫預處理前相比，P<0.01。

2.3高溫預處理前后血液白細胞HSP70mRNA的變化

C組受試者力竭運動后即刻，血液白細胞HSP70mRNA表達較安靜值顯著升高(P<0.01)，升高了2.96倍。運動后1 h的HSP70mRNA表達較運動后即刻顯著下降(P<0.05)。P1組HSP70mRNA在安靜時、運動后即刻及運動后1 h，均較C組相同時間點的值顯著升高(均P<0.05)，且分別升高了10.29倍、2.34倍和10.97倍。P2組HSP70mRNA在運動后即刻和運動后1 h，均較C組相同時間點的值顯著升高(P<0.05)，且分別升高了0.93%和3.18倍。P2組HSP70mRNA在安靜時、運動后即刻及運動后1 h，均較P1組相同時間點的值顯著下降(P<0.05)，且分別下降了72%、43%和65%。見圖1、圖2。

圖1　受試者血液白細胞HSP70mRNA表達變化

圖2　受試者血液白細胞HSP70mRNA(HSP70/β-actin)面積積分比值

2.4高溫預處理前后血清MDA含量、SOD活性的變化

C組力竭運動即刻血清MDA含量較安靜時顯著增加(P<0.05)。運動后1 h較即刻顯著減少(P<0.05)。P2組MDA含量在安靜、運動后即刻及運動后1 h較C組同時間點的值均顯著減少(均P<0.05)。見圖3。

圖3　受試者血清MDA含量(nmol/mL)變化

C組力竭運動后1 h血清SOD活性較運動后即刻顯著下降(P<0.05)。P1組SOD活性在運動后1 h較C組同時間點的值顯著升高(P<0.05)。P2組SOD活性在運動即刻和運動后1 h，均較C組同時間點的值顯著升高(均P<0.05)。見圖4。

圖4　受試者血清SOD活性(μ/mL)變化

2.5受試者力竭運動時最大攝氧量、血乳酸等指標的變化

C組、P1組和P2組在力竭運動時，最大心率(HRmax)、最大運動通氣量(VEmax)、相對最大攝氧量(VO2max/kg)、最大攝氧量(VO2max)、呼吸商(R)、運動力竭時間(Time)各指標均未出現顯著性變化(P>0.05) 。見表6。

P1組、P2組力竭運動中通氣閾時通氣量(VE)較C組均顯著增加(P<0.05)，其他指標包括心率(HR)、最大攝氧量利用率(%VO2max)、呼吸商(R)、最大心率百分比(%HRmax)均未出現顯著變化(P>0.05)。見表7。

C組、P1組和P2組受試者力竭運動后即刻血乳酸濃度較各組安靜值均顯著增加(均P<0.01)。C組、P1組和P2組受試者力竭運動后1 h血乳酸濃度較各組運動后即刻均顯著降低(均P<0.01)。P2組運動后即刻血乳酸濃度較C組、P1組均顯著增加(均P<0.01)。見圖5。

圖5　受試者力竭運動時血乳酸濃度(mmol/l)的變化

組別HRmax/(B/min)VEmax/(L/min)VO2max/kgVO2max/(mL·min)RTime/minC組183.6±9.55102.12±16.6449.86±7.193064±524.411.219±0.0514.18±0.86P1組193.78±7.16116.37±13.8253.22±3.133319.22±252.751.17±0.0614.4±0.85P2組192.6±5.06111.1±11.7050.79±5.693135.1±398.141.22±0.0513.98±0.82

表7　受試者力竭運動中通氣閾時的各指標變化

注：*表示與C組相比，P<0.05。

2.6相關性分析

圖6的相關性分析結果表明，受試者血液白細胞HSP70mRNA表達與血清SOD/MDA比例相關性密切，呈顯著正相關(R=0.48，P<0.05)。表明一次及多次高溫預處理后受試者血液白細胞HSP70mRNA表達增加，伴隨血清SOD/MDA比例的增加。

圖6　受試者血液白細胞HSP70mRNA與血清SOD/MDA比例相關性示意圖

3分析與討論

有研究發現，一次力竭運動[10]和長期運動訓練[11]均可造成機體HSP70合成增加。而兩種運動方式的時相性表現為，一次力竭運動后30—60 min，骨骼肌HSP70mRNA表達達到峰值，之后逐漸下降，6 h后恢復安靜水平[10]。而連續4周大強度訓練，運動員肌肉HSP70蛋白水平(訓練前為100%)從第一周到第四周分別增長181%、405%、456%和363%，呈下降趨勢。HSP70蛋白峰值出現在訓練第二周后[18]。同時研究發現運動員跑完半個馬拉松后，白細胞胞漿HSP70在運動后即刻、3 h、24 h顯著增加[19-20]。HSP70表達與運動時間和強度密切相關[21]。中等強度運動尚不足刺激HSP70表達增加，高強度訓練對HSP70的誘導更為顯著[22]。而關于運動誘導HSP70表達增加的機制，目前認為劇烈運動過程中ATP的減少、體溫升高、pH值改變、氧化應激損傷、乳酸堆積、運動引起的肌肉收縮、血流改變等應激，都可能是誘導HSP70增加的刺激因素[23]。

而本實驗證實，力竭運動后即刻人血液白細胞HSP70mRNA顯著增加，運動后1 h逐漸降低。本實驗還發現，一次及多次高溫預處理可顯著上調人血液白細胞HSP70mRNA表達，高溫預處理與運動疊加后HSP70mRNA表達進一步增加。文獻表明熱應激可導致HSP70合成增多，其合成量與受熱時間和程度有關。隨著HSP70表達增加，細胞存活率增加，受損傷程度減輕[24]。通過高溫預處理方式提前誘導HSP70產生，可增加機體抵抗損傷的能力，從而起到保護作用[2，12]。而HSP70表達的時相性研究發現，經冠狀靜脈竇逆行高溫灌注稀釋血液入心臟后大鼠心肌HSP70mRNA水平于15 min增加5倍，30 min增加10倍，60 min增加2倍[25]。而高溫預處理后大鼠肝臟HSP70表達在8—24 h達到最高峰[25]。而本實驗指標時相性結果發現，一次高溫預處理白細胞HSP70mRNA在運動后即刻及運動后1 h，較運動對照組分別升高了2.34倍和10.97倍。而多次高溫預處理HSP70mRNA在運動后即刻和運動后1 h，較運動對照組分別升高了0.93%和3.18倍。且多次高溫預處理后HSP70mRNA表達較一次高溫預處理降低，在安靜時、運動后即刻及運動后1 h，分別下降了72%、43%和65%。表明可能是機體對高溫重復應激的適應性反應。

本實驗采用一次遞增負荷至力竭的運動方案，發現運動對照組在運動后即刻，血清MDA含量較安靜時顯著增加，SOD活性有上升趨勢，此時HSP70mRNA表達在運動后即刻較安靜時顯著升高。說明力竭運動使機體脂質過氧化水平增加，而抗氧化酶活性提高不足以對抗ROS的增加，引起機體氧化應激損傷。文獻中降低氧化應激損傷的方式多樣，本實驗中采用了高溫預處理方案。研究表明，高溫預處理可增加大鼠腓腸肌和淋巴細胞HSP表達，提高肌纖維線粒體氧化酶活性，增加大鼠在高溫環境中的運動時間和耐力水平[24]。且高溫預處理的保護作用與HSP70表達上調呈正相關[3]。在本實驗中，一次高溫預處理后血清SOD活性在運動后即刻和運動后1 h，較運動對照組顯著升高。多次高溫預處理后MDA含量在運動后即刻和運動后1 h，較運動對照組顯著降低。而SOD活性在運動后即刻和運動后1 h顯著增加。此時一次及多次高溫預處理組白細胞HSP70mRNA在運動后即刻和運動后1 h均顯著升高，且HSP70mRNA表達與血清SOD/MDA比例呈顯著正相關。提示高溫預處理及運動雙因素刺激后HSP70mRNA表達顯著增高，可提高機體抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化水平，減輕力竭運動造成的氧化應激損傷。同時本研究發現，一次及多次高溫預處理組在運動后通氣閾值VE均較運動對照組顯著增加。通氣閾值可反映人體有氧工作能力，提示兩種高溫預處理方式可增強受試者的有氧工作能力。

研究表明，HSP70的分子保護機制包括抗氧化作用[26]、協同免疫作用[27]、分子伴侶作用、抗細胞凋亡作用[28-29]。HSP具有抗氧化的生物活性，HSP與其結合物可激活蛋白激酶C，增強蛋白酶活性，促進ATP水解，刺激內源性抗氧化劑的合成和釋放，從而抵抗過氧化物損傷。研究報道小鼠骨骼肌過表達HSP72，可增加血清抗氧化酶SOD活性，抑制氧化應激損傷，降低力竭運動造成的骨骼肌損傷和疲勞[26]。同時發現心肌過表達HSP72，可通過提高心臟Mn-SOD含量及活性，減少心肌細胞凋亡，對缺血再灌注心臟起到保護作用[29]。在本實驗中兩種高溫預處理方式抑制了力竭運動造成的氧化應激損傷，其機制主要體現在白細胞HSP70mRNA的抗氧化作用。

4結論

本研究發現一次及多次高溫預處理可上調運動后人血液白細胞HSP70mRNA表達，抑制力竭運動造成的氧化應激損傷。且多次高溫預處理后HSP70mRNA表達降低，可能是對高溫重復應激的適應性反應。

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收稿日期：2016-02-27

作者簡介：陳婷(1984-)，女，陜西西安人，講師，博士，研究方向為運動生理學。

中圖分類號：G804.2

文獻標志碼：A

文章編號：1008-3596(2016)04-0074-09

Effects of Hyperthermic Preconditioning on Blood Leucocyte HSP70mRNA and Oxygen Free Radical after Exhaustive Exercise

CHEN Ting, ZHANG Zhi-yuan, ZHANG Yue-juan

(School of Physical Education, Tibet University for Nationalities, Xianyang 712082, China)

Abstract：Objectives: To discuss the effects of two kinds of hyperthermic preconditioning on blood leucocyte HSP70mRNA and oxygen free radical after incremental exercise. Methods: The subjects are randomly divided into 3 groups: exercise control group(C) ,exercise after one hyperthermic preconditioning group(P1), and exercise after more hyperthermic preconditioning group(P2). P1 Group: The hyperthermic preconditioning is performed for an hour(Sauna, 46±1℃; relative humidity, 85%-90%). P2 Group: one hyperthermic preconditioning every three days, total eight times are performed. Group C applies Bruce protocol on treadmill to do incremental exercise to exhaustion. P1 and P2 Group are at rest under the normal temperature for 24 hours after hyperthermic preconditioning, and then do incremental exercise to exhaustion on treadmill. The maximum heart rate, maximal exercise ventilation, maximal oxygen uptake, respiration quotient are recorded at the end of the exercise, and the ventilation rate, maximal oxygen uptake utilization ratio are recorded at the same time. The elbow vein blood of C Group, P1 and P2 are collected before exercise, immediately after exercise, and 1 hour after exercise. By RT-PCR method, the tested groups’ expression of blood white cells HSP70mRNA are detected, content of malondialdehyde (MDA) in the serum is determined by the method of TBA and superoxide dismutase (SOD) activity is measured by the method of xanthine oxidase, blood lactic acid values is examined by the blood lactate analyzer. Results: in C Group, in immediate testing, the expression of HSP70mRNA and the content of serum MDA are significantly increased (P<0.01, P<0.05) compared with the test at rest. C Group after 1 hour’s exercise, HSP70mRNA expression and MDA content are significantly reduced compared with immediate testing (both P<0.05), while the serum SOD activity is significantly decreased (P<0.05) compared with immediate testing. Compared with C Group, HSP70mRNA expression in P1 Group increases significantly at rest, immediately and 1h after exercise(both P<0.05). SOD activity of P1 Group elevates significantly immediately after exercise (P<0.05). Compared with C Group, HSP70mRNA expression and SOD activity in P2 Group increases significantly at immediately and 1hour after exercise (both P<0.05), MDA content in P2 Group reduces markedly at rest, immediately and1hour after exercise (both P<0.05). Compared with P1 Group, P2 Group HSP70mRNA expression decreases markedly at rest, immediately after exercise, 1 hour after exercise (P<0.05). And HSP70mRNA is positively correlated with the production of SOD/MDA(R=0.48, P<0.05). Conclusions: Two kinds of hyperthermic preconditioning could increase leukocyte HSP70mRNA expression after incremental exercise, and reduce exhaustive exercise-induced oxidative damage. Leukocyte HSP70mRNA expression is decreased after one month hyperthermic preconditioning, this may be the adaptive response to repeated heat stress.

Key words：hyperthermic preconditioning; HSP70mRNA; oxygen free radical; superoxide dismutase; incremental exercise; exhaustion